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1、感受态 BL21、BL21(DE3)及 BL21(DE3)pLysSBL21没有T7 RNA聚合酶基因，因此不能表达 T7启动子控制的目的基因，但是可以表 达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。BL21(DE3)是入DE3溶原菌，带有 T7 RNA聚合酶，可用于表达 T7启动子控制的目的基 因，也可以表达大肠杆菌启动子 lac、tac、trc及trp控制的基因。BL21(DE3 pLysS含有pLysS质粒，一种与pET共存的表达T7裂解酶的质粒，可以减少目的基因的本底表达，提供更严紧的控制。真核原核启动子原核：几个常用的启动子和诱导调控表达系统1. 最早应用于的表达系统的
2、是Lac乳糖操纵子，由启动子 lacP + 操纵基因lacO +结构基因组成。其转录受 CAP正调控和lacI负调控。2.lacUV5突变能够在没有CAP勺存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受lacI的调控，因而随后得到了更广泛采用。lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO上 从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO,从而激活转录。这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。3. tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。4. trc启动子是trp启动子
3、和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。5. 在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高地表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为 Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc 载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现 严谨的诱导调控。6.IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代
4、替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30C下抑制转录，42C开始发挥作用。热诱导不用添加外来的诱导物， 成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物的稳定。7.以入噬菌体转录启动子PL、PR构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子受控于入噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控 PL、PR启动子的转录。同样也是 30C下阻遏启动子转录，42C下解除抑制开始转录。同样的，PL、PR表达载体需要以cI857(ts)作为表达菌株，现在更常见的做法是在
5、载体上携带cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主选择范围。另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控PL、PR启动子的转录。比如Invitrogen 的PL表达系统，就是将受trp启动子严谨调控的 cI基因溶源化到宿主菌染色体上，通过加入酪氨酸诱导抑制trp启动子，抑制cl基因的表达，从而解除强大的PL启动子的抑制。8.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙 的设计而成为原核表达的首选，尤其以 Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的 T7启 动子完全专一受控于 T7 RNA聚合酶，而高活性的 T7 RNA聚合酶合成mRNA勺速度比大肠杆
6、 菌RNA聚合酶快5倍一一当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA聚合酶，需要将外源的 T7 RNA聚合酶引入宿主菌，因而 T7 RNA聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式一一非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件控制T7 RNA聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。有几种方案可用于调控T7 RNA聚合酶的合成，从而调控T7
7、表达系统。1.噬菌体DE3是lambda噬菌体的衍生株，含有 lacI抑制基因和位于 lacUV5启动子下的T7 RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如 BL21(DE3)就是最常用的表达 菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac 一样都是IPTG诱导。2.另一种策略是用不含 T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋 白对宿主细胞的潜在毒性而造成的质粒不稳定。然后用入CE6噬菌体侵染宿主细胞一一CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变 (cI857ts)和pL/pR启动子控制T7 RNA聚合酶表达的衍生 株，在热诱导条件下可以激活T7 RNA聚合酶
8、的合成。此了噬菌体之外，还可以通过共转化质粒提供T7 RNA聚合酶。比如有人用受溶氧浓度控制的启动子调控T7 RNA聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控制。由于T7 RNA聚合酶的调控方式仍有可能有痕量的本底表达，控制基础表达的手段之一是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平；之二是采用带有T7 lac启动子的载体一一在紧邻 T7启动子的下游有一段lacI操纵子序列编码 表达lac阻遏蛋白(lacI) , lac阻遏蛋白可以作用于宿主染色体上T7 RNA聚合酶前的lacUV5启动子并抑制其表达，也作用于载体 T7 lac启动子，以阻断任何 T7 RNA聚合酶导 致的目的基因转录。pL
9、acI工转化也是同样的原理。如果这还不够，更为严谨调控手段还有 在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7 RNA聚合酶的基因一一T7溶菌酶基因，降低本底。常用的带溶菌酶质粒有 pLysS和pLysE,相容的ori都不会影响后继的表达质粒转化， 前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多，对细胞生长影响小，而pLysE会明显降低宿主菌的生长水平，容易出现过度调节，增加蛋白表达的滞后时间，从而降低表达水平。通过几种不同方法来巧妙调控 T7聚合酶合成，T7启动子发展出了史上功能最强大，最丰富的表达系 统。真核：真核表达系统的研究进展自上世纪70年代基因工程技术诞生以来， 基因表达技术已渗透到生命科学研究的各
10、个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体(一般为质粒)转化细菌（通常选用的是大肠杆菌），通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于 能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难； 而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。因此，利用真核表达系统来表达
11、目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。1. 酵母表达系统最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有 H Polymorpha , Candida Bodini , Pichia Pastris3 种。以 Pichia Pastoris 应用最多。 甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因
12、一 1（A0x1），在该基因的启动子（PAXOI）作用下，外源基因得以表达。PAXOI是一个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中AOx 1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时PAXOI可被诱导激活，因而外源基因可在其控制下表达，将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。此外甲醇酵母的表达载体都为E.coli /Pichia Pastoris 的穿梭载体，其中含有 E.coli复制起点和筛选标志，可在获得克隆后采 用E.coli细胞大量扩增.目前，将质粒载体转入酵母菌的方法主要有原生质体转化法、电击法及氯化锂法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培
13、养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。 这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。利用PAXOI表达外源蛋白时，一般需很长时间才能达到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危险 性化工产品。使得实验操作过程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生产。因此那些不需要甲醇诱导的启动子受到青睐包括GAP FLD1、PEX8 YPTI等多种。利用三磷酸甘油醛脱氢酶（GAP）启动子代替PAXOI,不需要甲醇诱导。培养过程中无需更换碳源，操作更为简 便，可缩短外源蛋白到达峰值水平的时间。酵母表达系统作为一种后起
14、的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点， 正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。2. 昆虫细胞表达系统杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒（AcNPV）作为表达载体。在 AcNPW；染昆虫细胞的后期，核多角体基因可编码产生多角 体蛋白，该蛋白包裹病毒颗粒可形成包涵体。核多角体基因启动子具有极强的启动蛋白表达能力，故常被用来构建杆状病毒传递质粒。克隆入外源基因的传递质粒与野生型AcNPV共转染昆虫细胞后可发生同源重组，重组后多角体基因被破坏，因而在感染细胞中不能形成包涵体，利用这一特点可挑选出含重组杆状病毒的昆虫细胞但效率比较低，且
15、载体构建时间长，一般需要46周。此外，昆虫细胞不能表达带有完整N联聚糖的真核糖蛋白。在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂解，胞质内的物质释放出来， 与目的蛋白混在一起， 从而使蛋白的纯化工作变得很困难，另外水解酶的释放会降解重组蛋白。为了克服以上这些困难，科学工作者先后尝试用丝蛾肌动蛋白基因启动子或杆状病毒 ie-1基因启动子表达外源蛋白，但效果都不明显。Farrel等介绍了一种新型的鳞翅目昆虫细胞表达系统，该系统主要包括3个调节外源蛋白表达序列：（1） Bombyx mori的肌动蛋白基因启动子；（2） Bombyx mori的核型多角体病毒（BmNPV）勺立早基因ie-1（编码俄IE-1蛋 白，该蛋白是种转录激活因子，可在体外激活肌动蛋白基因启动子）；（3） BmNPV的同源重复序列3（HR3）可作为肌动蛋白基因启动子的增强子。三者协同作用，可使转录活性提高1000倍以上，从而大大地提高外源蛋白的表达水平。另外目前还有一种新型的宿主范围广的杂合核多角体病毒（HyNPV）被应用于昆虫细胞表达系统的构建，该病毒由AcNPV及BniqP发展而来。一般情况下杆状病毒表达系统所能表达的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分为非分泌性
