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1、原代培养肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最正确生物材料。长期以来,国外众多学者对肝细胞别离方法、培养条件进展了大量的研究,但要获得高活率、功能好的肝细胞,至今仍非易事。早期主要用非酶法别离肝细胞,包括机械法（如匀浆法）及螯合法。机械法对肝细胞损伤大,细胞活率低;螯合法是用可结合Ca2+、Mg2+的螯合剂（如枸橼酸盐或EDTA）别离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好,常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法别离肝细胞,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。后者对酶浓度及作用时间要求十分严格,且由于胰蛋白酶是一种强蛋白质消化酶,对肝细胞膜破坏严重,因而易造成肝细胞死亡,导致别离失败。胶原酶消化法对肝细胞
2、损伤较小,虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害,但经培养后可完全修复。胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体,使肝细胞能逐渐适应消化别离过程中所发生的细胞、外环境及细胞间的各种改变。这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用,有利于肝细胞的培养。这种适应性改变恰恰是机械别离法所没有的。因此,要获取理想的肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。Seglen二步灌注法为经典的胶原酶消化法,但所需设备较复杂,胶原酶消耗量大。本研究在其根底上略加改良。作者认为,采用胶原酶消化法,胶原酶的用量、作用时间及作用条件是别离成功与否的关键。胶原酶的浓度过高,作用
3、时间难以控制;浓度过低,那么作用时间过长、细胞活率降低。事先用无Ca2+、Mg2+的灌注液进展预灌注，去除Ca2+依赖性粘附因子，使桥粒断裂；然后用含Ca2+的胶原酶消化，胶原酶的作用需要Ca2+的活化,在5mmol/LCa2+浓度下,用浓度为500mg/L的胶原酶37条件下消化15min最正确。在进展肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时,温度需保持在。4C。肝细胞别离时,pH值宜维持在7.4左右,不低于7.2,最高不超过7.6,否那么将对肝细胞造成很大损伤。在肝灌注液中参加适量的小牛血清或者牛血清白蛋白,可以维持细胞代和液体渗透压,提高肝细胞成活率。此外,门静脉插管应迅速置入,灌注速度必须保持
4、一致。培养板预处理及培养液选择采用铺过胶原的新培养板与没有铺过胶原的新培养板,铺过胶原的老培养板培养肝细胞比拟,发现肝细胞在铺过胶原的新培养板中长势更好。新的培养板使用Sigm泌司提供的胶原铺胶,置于37恒温箱中过夜后使用。过去选择含8%胎牛血清的WE作培养基，效果不错，但WE价格昂贵，我们试着采用含10%胎牛血清的RPM1640培养基,并在其中参加胰岛素,地塞米松等生长因子,肝细胞生长好。肝细胞的接种密度对其以后的生长状况有很大的影响:密度太小,细胞不易生长;密度太大,肝细胞增殖受到抑制,培养板中缺少足够的空间供细胞伸展。当细胞密度为5X105/ml左右时,试剂及仪器主要试剂：胰岛素、高血糖
5、素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、IV型胶原酶、锥虫蓝等购自美国Sigma公司。鼠尾胶为自行配制。WilliamsE培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司。BT01-100蠕动泵（格兰蠕动泵）、Sorvall低温离心机（美国Kendro公司）,CL-800全自动生化分化仪（日本岛津）,XD-101倒置显微镜（光学显微镜公司）。HeraeusCO2孵箱（美国Kendro公司）,KT-902干净室（康达净化空调设备厂）。实验步骤：一、原代大鼠肝细胞的别离1.实验动物Spragure-DawleySD大鼠购自医学院实验动物中心。雄性，清洁级，体重150200g812周龄。分笼饲养，喂饲标准的大鼠
6、饲料，随意饮水，保持室温20C25C。2.主要仪器设备：倒置相差显微镜；自动平衡微型离心机：LDZ4-0.8医用离心机厂；套管针；超净工作台；电子分析天平；外科手术器械3主要试剂及药品：IV型胶原酶；RPMI164嘴养基；胎牛血清；台盼蓝；Percol刷离液；PBSS冲液；青霉素80万U及链霉素100万U胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松4.具体实验步骤：SD大鼠，氯胺酮80mg/kg腹腔麻醉同时腹腔注射1000U肝素钠注射液抗凝固定大鼠仰卧位于超净工作台上用前紫外灯照射超净台半小时，剪去胸腹部体毛，碘伏胸腹部皮肤消毒后，带无菌手套，铺洞巾，取腹部正中切口，可见鲜红的肝脏，暴露
7、出门静脉和肝下下腔静脉，用弯头钳子钝性别离门静脉和下腔静脉，并在各静脉下放置1根4零细线，暂不结扎，用套管针以约15角在门静脉远端向近端平行刺入注意针头刺入在距离门静脉3个分支处0.5cm,刺入过深势必影响灌注效果.细线结扎后以封闭门静脉远端，再退出金属针心，并将套管针连接一次输液器一端，另一端接上输液瓶预热灌流液的输液瓶用保温套保持温度以防止温度下降过快以影响酶的消化活性输液瓶高度距离灌流大鼠肝脏120cm翻开输液器输钮将预热至37无钙灌流液200mL经一次性输液管道及连接其末端的套管针流入门静脉，控制流速约20mL/min；另一套管针头立即插入肝下下腔静脉，细线结扎固定以防针头由下腔静脉脱
8、出并退出金属针心，让血液和灌流液从下腔静脉流出，用无菌平皿接流出液，保持流出端无菌，同时翻开胸腔结扎肝上下腔静脉，数分钟后肝脏逐渐肿胀变淡黄色直到下腔静脉流出液颜色接近无钙灌流液.约510min,改输预热至37C的0.05%IV型胶原酶灌流液100mL继续灌流，更换流出端的平皿，以回收胶原酶以循环使用，控制约10mL/min.灌流持续约510min,0.05%IV型胶原酶灌流过程中，取一根无菌湿棉签轻轻压迫肝脏外表，以判断肝脏消化的程度，待压迫肝脏后不再回缩外表出现渗出、肝包膜下组织呈龟背状裂隙时判断肝脏已被消化充分，可以终止灌流。离断肝脏血管、韧带及系膜，将肝脏完整取下注意不要碰破胃肠组织，
9、防止造成污染，置于无菌平皿。用眼科镊钝性撕裂肝组织，4RPMI1640完全培养基终止IV型胶原酶的消化作用，装入无菌100mL三角烧瓶置摇床上，100r/min，摇10min，所得的肝细胞悬液经三层无菌纱布过滤，以除去一些大的细胞团块及被膜组织，再装入50mL离心管，500r/min,离心3min,弃上清，以4cRPMI1640完全培养基重悬，反复离心3次，以除去血细胞、肝非实质细胞以及一些细胞碎片和少量的结缔组织。离心之后得到的肝细胞沉淀以含4RPMI1640完全培养基对细胞沉淀进展重悬，用吸管轻轻反复吹打肝细胞悬液使肝细胞重悬均匀后即制备成肝细胞悬液。二、原代大鼠肝细胞的纯化取无菌的50m
10、L离心管置管架上，用弯头吸管沿管壁小心地将肝细胞悬液和75%Percoll别离液按1:1铺层，底层为75%Percoll别离液肝细胞悬液铺加于上层，尽量减少震荡，4C,800r/min,10min离心后，离心管液体分四层，顶层为死细胞，第二层为混合肝细胞，第三层为肝实质细胞，底层为别离液取第三层肝实质细胞用于重悬制成肝细胞悬液外，另吸取第二层混合肝细胞，加PBS液稀释，再次小心依次按1:1:1分铺底层50%Percoll、中层25%Percoll、顶层混合肝细胞悬液，尽量减少震荡，4，800r/min，10min离心，底层沉淀为肝实质细胞，吸除上层液，用完全培养基重悬底层沉淀的肝细胞制成肝细胞
11、悬液取肝细胞悬液与台盼蓝溶液混匀后1min滴入血细胞计数板上计数。三、肝细胞原代培养详细步骤RPMI164犹全培养基（100mL!_1胎牛血清RPMI1640W养基培养基、青霉素105UI-L1、链霉素100mcg-L1和胰岛素160U-1）调整肝细胞悬液细胞密度，按每孔1X106个细胞接种于铺有肝细胞悬液的6孔培养板中，在37C、50mL-L1CO2常规培养条件下培养。4h后换液，用RPMI164院全培养基继续培养，以后每24h换液1次，在倒置显微镜下动态观察细胞的形态6孔培养板中，在37C、50mL-L-1CO2常规培养条彳下培养。4h后换液，用RPMI164谎全培养基继续培养，以后每24h换液1次，在倒置显微镜下动态观察细胞的形态变化。
