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1、论文范文题目：胎盘球蛋白的制备及体内外的免疫抑制作用医学论文_医药学论文编辑：小小 刘凌波，黎纬明，何伟，邹萍 【摘要】 为了研究小鼠急性粒-单核白血病细胞株WEHI-3细胞外表免疫应答分子Fas、Fas配体FasL、CD80分子表达以及FasL的功能，应用流式细胞术检测WEHI-3细胞外表Fas、FasL和CD80分子表达情况，同时采用氚胸腺嘧啶核苷3H-TdR掺入法检测FasL功能。结果说明： WEHI-3细胞外表CD80和Fas表达率分别为5.060.41、6.752.31n5，但FasL表达率高达63.735.23n5，当WEHI-3效应细胞，E和FasYAC-1细胞靶细胞，T以31、
2、101和301混合培养时，YAC-1细胞的凋亡率分别为264.5，353.2和432.7n5。结论： WEHI-3细胞高表达FasL，低表达Fas和CD80，并能诱导FasYAC-1细胞凋亡。 【关键词】 急性粒单核细胞白血病Expression of Immune Response Molecules and Function of Fas Ligand on Surface of AML WEHI-3 CellsAbstract The purpose of this study was to investigate the expression of Fas、Fas ligandFasL
3、and CD80 and function of FasL on the surface of acute myelomonocytic leukemia cells from WEHI-3 line. The expression of Fas、FasL and CD80 on the surface of WEHI-3 were detected by flow cytometry，the apoptosis of YAC-1 cell induced by FasL on the surface of WEHI-3 were detected by 3H-TdR incorporatio
4、n. The results showed that the expression rate of Fas、FasL and CD80 on the surface of WEHI-3 cells were (6.752.31)n5、(63.735.23)n5and (5.060.41)n5respectively. The apoptosis rate of YAC-1 cells target cellsco-cultured with WEHI-3 cellsEffector cells at the rate of 13、110 and 130 were (264.5)、(353.2)
5、 and (432.7) n5respectively. It is concluded that WEHI-3 cells have high expression of FasL and low expression of Fas and CD80 on their cell membrane，and can induce the apoptosis of Fas+ YAC-1 cells.Key words acute myelomonocytic leukemia; FasL; Fas; CD80; WEHI-3 cell白血病细胞免疫逃逸可能是白血病发生、开展的重要环节。文献报道，肿
6、瘤细胞可能主要通过以下途径逃逸机体T细胞的免疫监视：肿瘤细胞膜高表达as配体(Fas ligand，as)，并通过as-as途径还击T细胞，肿瘤细胞膜缺失或低表达免疫反响的正性调节因子，如共刺激分子CD80，使T细胞对肿瘤细胞抗原刺激无能应答1-4。因此，本研究调查小鼠急性粒-单核细胞白血病acute myelomoncytic leukemia，AML细胞株WEHI-3细胞表达as、as和CD80的状况及其功能，初步探讨急性粒-单核细胞白血病的可能的免疫逃逸机制。材料和方法细胞株和试剂小鼠急性粒-单核细胞白血病细胞株WEHI-3购自中国医学科学院根底医学研究所细胞中心。小鼠T淋巴瘤细胞株YA
7、C-1购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。DMEM培养液、RPMI 1640培养液、胎牛血清购自Gibco BRL公司。 3H-TdR北京原子能研究所产品，液体闪烁测量仪为FJ-2107型西安262厂产品，FITC标记的CD80单克隆抗体和同型对照抗体Southern Biotech公司产品，生物素标记的抗小鼠FasL抗体和同型对照抗体，PE标记的链酶亲和素和Fc封闭抗体CD32抗体购自PharMingen公司，FITC标记的抗Fas单克隆抗体和同型对照抗体购自Southern Biotech公司。WEHI-3外表CD80表达率检测WEHI-3细胞在含10%胎牛血清、0.2 mmol/L
8、左旋谷胺酰胺、青霉素100 U/ml、链霉素100 g/ml的DMEM/高糖培养液中，于37、5% CO2、完全饱和湿度条件下传代培养。收集悬浮细胞，用台盼蓝拒染法计数，以活细胞数不低于95%的WEHI-3细胞制备密度为2.0106/ml的单细胞悬液，取0.5 ml单细胞悬液，参加FITC标记的CD80单克隆抗体或同型对照抗体0.5 g，4染色30分钟后流式细胞仪检测。同样实验重复5次。WEHI-3外表FasL表达率检测WEHI-3细胞经消化液消化后以每管5105细胞悬浮，参加98 l含2% FCS的细胞悬液和2 l Fc封闭抗体，4、5分钟后参加同样浓度的4 l抗小鼠FasL单克隆抗体或同型
9、对照抗体。洗涤后参加含2% FCS的PBS 96 l和PE标记的链酶亲和素4 l，进行流式细胞仪检测。同样实验重复5次。WEHI-3外表Fas表达率检测收集悬浮的WEHI-3细胞，用台盼蓝拒染法计数，以活细胞数不低于95%的WEHI-3细胞制备密度为2.0106/ml的单细胞悬液，取0.5 ml单细胞悬液，参加FITC标记的抗Fas单克隆抗体或同型对照抗体0.5 g，4染色30分钟后流式细胞仪检测。同样实验重复5次。FasL功能实验采用氚胸腺嘧啶核苷3H-thymidine，3H-TdR掺入法检测5FasL功能。实验设立样品组、空白对照组和最大释放组。取0.1 ml5106个YAC-1细胞，除
10、空白对照组外每组参加1 mCi的3H-TdR，用含10% FCS的RPMI 1640培养液于37、5% CO2过夜培养15小时。离心洗去未掺入的3H-TdR。用同位素微量加样器各取100 l 12104个YAC-1细胞和100 l各种浓度的WEHI-3细胞混合于96孔培养板中；最大释放组不加WEHI-3细胞，而加抗Fas单克隆抗体100 ng/ml可引起YAC-1细胞100%凋亡。37孵育24小时，取100 l培养上清参加含闪烁液的测量杯中，用液体闪烁测量仪检测放射强度，结果以每分钟脉冲数cpm表示，并用最大释放作用进行标化。效应细胞FasL功能，即诱导凋亡的百分率=实验组cpm-自然释放cp
11、m/最大释放cpm-自然释放cpm。同样实验重复5次。统计学处理数据以均值标准差xSD表示。结 果WEHI-3外表的CD80表达CD80 是有效活化肿瘤特异CTL必需的共刺激信号之一，它的缺乏往往导致肿瘤特异 CTL 无能，使肿瘤细胞逃逸免疫监视；为此，我们检测了CD80在WEHI-3细胞外表表达的情况，结果发现CD80抗原的表达率很低，仅为5.060.41n5图1。这提示WEHI-3细胞可能存在类似的免疫逃逸机制。WEHI-3外表的Fas表达Fas是FasL启动细胞凋亡的重要信号传导分子，肿瘤细胞往往通过低表达Fas而逃避T细胞的杀伤。本研究发现WEHI-3细胞外表Fas的表达率仅为6.75
12、2.31n5图2，这说明WEHI-3细胞外表同样低表达Fas。WEHI-3外表的FasL表达率FasL在很多肿瘤细胞中高表达，并杀伤FasCTL，发生免疫逃逸。本实验发现WEHI-3外表FasL表达率为63.735.23n5图3，提示WEHI-3外表高表达 FasL 分子。WEHI-3外表的FasL功能实验为了探讨WEHI-3外表高表达的FasL分子能否诱导Fas细胞凋亡，本研究将WEHI-3细胞效应细胞，E与YAC-1细胞靶细胞，T以31、101和301混合培养24小时后，发现YAC-1细胞的凋亡率分别为264.5，353.2和432.7n5图4，从而证实WEHI-3外表的FasL具有诱导F
13、as细胞凋亡的能力，这一结果高度提示WEHI-3外表的FasL可能参与其免疫逃逸。讨论WEHI-3是小鼠急性粒-单核白血病细胞株，目前尚未见关于其免疫逃逸机制的报道。近几年来的研究证实，FasL/Fas系统还击是肿瘤免疫逃逸的主要机制之一。T细胞活化为细胞毒T淋巴细胞CTL后，高表达FasL，通过FasL来诱导Fas靶细胞的凋亡，发挥细胞毒效应；但FasL也高表达于多种肿瘤细胞，这样T细胞激活后上调Fas并对Fas介导凋亡敏感时，肿瘤细胞便可能通过FasL反向攻击杀伤T细胞。本研究证实，WEHI-3细胞的FasL表达率高达63.73，并具有诱导FasYac-1细胞凋亡的作用，与Buzyn3等的
14、研究一致。同时，肿瘤细胞还可以通过低表达Fas，对FasL/Fas系统介导的凋亡信号不敏感而发生FasL/Fas系统抵抗。本研究发现WEHI-3细胞的Fas表达率仅为6.75，与Bremner等5的研究结果类似，提示WEHI-3细胞可能通过高表达FasL杀伤FasCTL，通过低表达Fas而抵抗CTL的FasL攻击，导致WEHI-3逃逸CTL的免疫监视。机体抗白血病免疫应答的有效产生需要以下两种信号：白血病抗原肽主要组织相容性复合物MHC与T细胞的抗原受体TCR结合，提供T细胞活化的第一信号；同时，白血病细胞和抗原呈递细胞APC表达共刺激因子，与T细胞上的相应配体结合，提供T细胞活化的第二信号。
15、双信号模式是T细胞充分活化的必需条件，缺一不可6。与Whiteway等4的研究结果类似，本研究发现，WEHI-3细胞外表的CD80表达率极低，仅为5.06。 WEHI-3细胞低表达CD80分子，使得白血病抗原在缺乏必要的共刺激信号的条件下非正常地呈递给T细胞，最终可能导致T细胞无能，从而逃避机体免疫系统的攻击。总之，本研究对WEHI-3细胞系的局部免疫逃逸机制进行了初步的探索，为开展白血病的免疫治疗提供了实验根底。但目前发现很多机制导致肿瘤免疫逃逸，包括肿瘤抗原表达异常、MHC依赖性抗原提呈途径异常、以及T细胞信号转导缺陷等7-9，在WEHI-3细胞是否也同时存在，仍需进一步研究证实。【参考文献】1Walker PR，Saas P，Dietrich PY. Role of Fas ligand (CD95L) in immune escape: the tumor cell strikes back. J Immunol，1997
