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1、生物资源学课程论文海南大学食品学院课程论文报告课程名称：生物资源学课程论文题目：青蒿素的提取与分离姓 名：学 院：食品学院专 业：食品科学与工程年 级： 学 号：指导教师：职 称：2011年 11 月22日海南大学食品学院生物资源学课程论文结果评定评定内容评定指标评分权值评定成绩论文格式格式规范、结构合理、内容完整，4000 字以上。0.2论文质量立论正确，论述充分，结论严谨合理；文字通顺，表述清晰。技术用语准确，符号统一，编号齐全，书写工整规范，图表完备、整洁、正确；论文结果有应用价值0.6工作创新论文要有新见解；对前人工作有改进或突破，或有独特见解。0.2成绩：指导教师签字：任务下达日期：
2、2011年11月22日评定日期：2011年12月30日青蒿素的提取与分离摘要：青篙素是一种低毒、高效的抗疟药物，同时对许多肿瘤细胞都有一定的毒性，青蒿素类化合物和类似物的研究引起了世界范围的广泛兴趣，近些来这方面的研究也取得了不少进展。 关键词 青蒿素；抗疟疾；制备；分析青篙素是我国在国际上有知识产权的第一种药物，是我国第一个经世界卫生组织认可生产出口的药品，我国科学工作者首次从菊科植物黄花篙中提取出来的具有抗疟活性成分的中药成分。青篙入药在我国己有悠久的历史，始见于公元前168年左右的马王堆三号汉墓出土的帛书(五十二病方，其后在神农本草经,大观本草及本草纲目等均有收录。1青蒿素的性质青篙素(
3、从emisinin，Qinghaosu，QHS)分子式C15H22O5，分子量282.35，根据化学反应、光谱数据和单晶衍射测定证明青篙素是一种具有过氧桥键的新型倍半帖内酷 (见图1)， 图1-青蒿素结构式这种结构在人类抗疟药物化学史上属首创。纯净的青篙素是无色针状晶体，不溶于水，溶于氯 仿，丙酮，乙酸乙酷，乙睛，乙醇，甲醇等。其衍生物主要双氢青篙素，青篙甲醚，青篙乙醚，青篙唬醋等，都具有一定的药理活性。2 青篙素的药理活性青篙素的发现成为世界抗疟药史上继奎宁之后的又一个重要里程碑。由于其结构独特，抗疟机理特别，对抗氯喳的恶性疟和脑性疟有特效，且高效低毒的特点，而被WHO称为“世界上目前唯一有
4、效的疟疾治疗药物。与此同时，国内外学者进行了大量的药理及临床研究。实验表明在疟原虫红内期内，青篙素能有效干扰疟原虫的表膜一线粒体功能，阻断了以宿主红细胞浆为营养的供给，直接杀伤疟原虫。此外青篙素在其他疾病的治疗中也显示出诱人的前景。如抗血吸虫，调节或抑制体液的免疫功能，提高淋巴细胞的转化率，利胆，祛痰，镇咳，平喘等。目前，已研制出了第二代换代产品和用青篙素治疗肿瘤、黑热病、红斑狼疮等疾病的衍生新药，同时开始探索青篙素治疗艾滋病、恶性肿瘤、利氏曼、血吸虫、涤虫、弓形虫等疾病以及戒毒的新用途。世界卫生组织把遏制疟疾列为本世纪头号医学课题。目前全世界每年抗疟药销售额高达巧亿美元，但主要为西方国家制药
5、厂垄断。我国尽管在抗疟药研制方面处于世界领先水平，但生产没有规模化，每年青篙素类药的出口额不足700万美元。3青蒿素的制备 3. 1有机溶剂萃取青蒿素为白色针状结晶, 易溶于氯仿、丙酮、苯、乙酸乙酯, 可溶于乙醇, 乙醚等。传统工艺用有机溶剂萃取青蒿中的有效成分, 然后用重结晶或柱层析等分离精制得到青蒿素。工艺路线一般如下: 干燥-破碎- 浸泡- 萃取(反复多次) - 浓缩- 粗品- 精制。该法优点是工艺路线成熟, 易于工艺化。缺点是需经过多次萃取浓缩, 步骤多, 能耗高, 周期长, 同时部分溶剂逃逸会造成环境污染。 3.2超临界CO 2 萃取超临界流体萃取是一种新兴的萃取分离技术。超临界流体
6、具有较高的扩散传质速率和溶解性能(通过改变CO 2 密度和温度、压力等操作参数可改变青蒿素的溶解性) , 在有效成分含量较低的天然药物等的提取分离方面有独特的优势。该法将CO 2 高压液化作为萃取剂, 工艺路线简单(主要是加压逆流和减压蒸发) 周期短, 常温可进行(青蒿素几乎不发生热裂解等化学反应)。CO 2 价格低, 无毒, 不燃, 可循环使用, 生产无环境污染。萃取物中杂质含量低, 提纯简单, 收率高, 但一次性设备投资大。 3.3化学合成目前世界上青蒿素类药物的生产主要是从青蒿植物中提取, 但是青蒿植物中青蒿素的含量较低, 难以满足市场需求。1983 年许杏虎等人完成了从青蒿酸到青蒿素的
7、半合成。1983 年Schm il 等以异薄勒酸为原料经13 步反应得到青蒿素。1986 年, 许杏虎等报道了以R (+ ) - 香草醛为原料, 经十几步的青蒿素全合成。1992 年A verty 等人以薄勒醇为原料合成青蒿素。青蒿素虽已能化学合成, 但成本高、毒性大、产量低难以进行商业化生产。 3.4植物组织培养利用植物组织培养青蒿素从而改变青蒿素依赖天然的局面, 是研究的新热点。国家“九五”攻关项目“大规模植物细胞培养生产青蒿素”。利用基因工程技术, 令发根农杆菌诱导黄花蒿(青蒿素含量较高) 发根。还有学者利用生物反应器、流化床反应器、气生式内环流生物反应器等培养青蒿素均取得了较好成效。
8、3.5生物合成 青篙素生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径，可分为三大步:由乙酸形成FPP，合成倍半裕，再内醋化形成青篙素。Wallwaart 将生物合成途径概括为:FPP-4,11一二烯倍半菇一。青篙酸、二氢青篙酸、二氢青篙酸过氧化物、青篙素。植物类异戊二烯生物合成存在甲轻戊酸和丙酮酸P磷酸甘油醛两条途径。青篙素等倍半裕类的生物合成途径在细胞质中进行，属于甲经戊酸途径。1987年，Akhila等通过放射性同位素示踪法发现青篙素的生物合成途径为:FPP-青篙酸、二氢青篙酸、青篙素，如图1所示。生物合成青篙素的途径近年来引起了广泛关注，但目前的工作仅涉及合成青篙素的生物合成中体(te)，而青篙
9、素最终产品的研究进展不大，且鲜见报道。但这恰恰是可能提高青篙素市场供给的最重要途径，因此要全面加大青篙素最终产品生物合成的研究力度3.6 酵母工程青蒿素生物合成相关基因导入:酵母是单细胞真核生物,无论在蛋白质的翻译后加工、基因的表达调控还是生理生化上,都与植物十分相似,酵母表达系统是一种理想的植物细胞基因表达体系。Lindahl等分别利用质粒载体和整合载体将青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因转入酵母中,通过对转基因酵母的16 d培养,均积累了紫穗槐-4,11-二烯产物。其中,通过高拷贝酵母表达质粒pYeDP60获得的转ADS基因酵母,紫穗槐-4,11-二烯产量达600g/L;而通过同源基因重组
10、方式将ADS基因整合到酵母染色体的转基因组酵母,积累了100g/L紫穗槐-4,11-二烯。Ro等将青蒿ADS基因亚克隆入pRS425质粒,转入酵母细胞中,在GAL1启动子的控制下得到了表达,合成了4.4 mg/L的紫穗槐-4,11-二烯。此后,他们又将细胞色素P450氧化还原酶基因CPR通过由半乳糖启动子控制的质粒载体,转入转ADS基因的酵母中,但未检测到青蒿酸产物,而将青蒿中P450单氧化基因CYP71AV1与CPR同时转入,在半乳糖的诱导下,转基因酵母积累了青蒿酸。3.7微波辅助萃取萃取传统的萃取过程中，能量首先无规则地传递给萃取剂，然后萃取剂扩散进入机体物质，再从基体溶解或夹带多种成分扩
11、散出来，即遵循加热一渗透进基体一溶解或夹带一渗透出来的模式。微波萃取法是利用微波能来提高萃取效率的一种新技术。不同物质的介电常数不同，其吸收微波能的程度不同，由此产生的及传递给周围环境的热能也不同。在微波场中，吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得被萃取物质从基体或体系中分离，进入到介电常数较小，微波吸收能力相对较强的萃取剂中。刘征涛等人采用频率为245OMHz或915MHz，功率为500一15000瓦的微波对黄花篙植物碎料在选自水，Cl一C4的醇，乙醚，丙酮或其混合物的溶剂中进行初次约10min的预提1一3次;然后用选自汽油，石油醚，Cl一C3醇
12、及其混合物的萃取液对微波萃取所得初提液进行再次提取约5min的1一3次。然后精提，浓缩，纯化，得到青篙素纯度在95%以上的制品。4. 青篙素的分析测定方法4.1定性分析 ( 1) 薄层层析法. 吸取一定量样品青蒿素溶液, 点样于以硅胶G 或硅胶- CMC-Na 制作的薄板上, 采用石油醚- 乙酸乙酯( 8： 2) 或苯- 乙醚( 4： 1) 作展开剂, 再以香草醛浓硫酸 作显色剂, 结果是青蒿素呈鲜黄色斑点, 继而又变为潮蓝色 ; 或用110 活化1 h 的层析硅胶片, 点样后, 以石油醚( 60 90 ) - 乙醚( 6 ： 4) 为展开剂, 展开后挥去溶剂, 以0. 25 g 对二甲氨基苯
13、甲醛溶于50 mL冰醋酸、5 g =85%磷酸和20 mL 蒸馏水的混和液作显色剂, 80 烘箱中烘0. 5 h 取出, 呈蓝紫色斑点.( 2) 显色法. 即利用青篙素化学性质中的显色反应作为检测青篙素的方法.4.2定量分析4.2.1用于含量较高时的定量分析 这些方法的优点是准确简单, 缺点是选择性和灵敏度均较低, 不适于成分复杂、含量较低样品的测定. 根据测定方法的机理不同, 可分为3 类:( 1) 利用青蒿素分子的过氧基进行测定 目前常用的有碘量法和脉冲极谱法.采用经过改进的桥式有机过氧物碘量法测定. 其改进之处是避免常规碘量法以极易氧化碘离子的冰醋酸为酸性介质, 改用2. 5 mol/
14、L 的硫酸为酸性试剂和无水乙醇组成的酸性介质, 以便在增加碘离子的浓度的同时, 减少自身氧化产生的碘. 此法在42 下恒温1 h 回收率较理想.采用的脉冲极谱法则利用过氧桥可还原的性质, 选用0. 05 mo l/ L 的硫酸氨铵为底液, 青蒿素于0 V( vsSCE) 处出现一良好峰形, 质量浓度在0 16 mg / L 范围与波高呈线性关系, 测定下限为2 mg/ L.( 2) 利用内酯在碱性条件下水解开环的特性测定 青蒿素分子中的内酯及过氧七元环结构能在碱性条件下水解开环,等当地中和碱, 其突跃范围是pH 值7. 2 11. 0, 终点在pH 值8. 9 附近, 与酚酞的PT 相符. 因
15、此, 既可用指示剂指示终点、又可用电位指示终点的滴定分析法来测定样品青蒿素的含量 .( 3) 用碱或酸将青蒿素定量分解成有紫外线吸收的化合物, 再进行测定。 用碱处理的机理是使青蒿素转变成在292 nm处有明显吸收峰的新化合物而进行测定. 此法经改进后, 青蒿素乙醇液用= 0. 2%的NaOH 溶液处理, 50 反应30 min 结果较为理想 . 也可将碱化后max = 292 nm 反应液, 酸化为ma x = 260 nm 的溶液进行测定. 实验证明, 这一转化全部完成存在一个临界pH 值 . 另外, 用H PLC 也可以. 方法是用异辛烷、甲醇、乙醇混和液作流动相, 在Silica A 硅胶柱上作正相洗脱; 用甲醇- 水溶液作流动相, 在PEAB-ODS 10 m 柱上作反相洗脱. 以胆固醇作内标, U V 检测, 可测青蒿素含量 .4.2.2 用于低含量且成分复杂的测定方法薄层扫描定量法 ( 1) 薄层扫描定量法 此法适用于多组分物质和微量组分含量的测定. 较其他一些薄层层析定量法, 该方法具有准确度好、灵敏度高、方法简便、快速等优点. 其做法是在硅胶G 板上
