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1、广东溢多利 生物科技股份有限公司纤维素酶 酶活力的测定方法编号:VTR-J-07-3-C/0-05颁发部门：品管部技术标准（国标）页码：共2页第1页1. 目的建立纤维素酶活力的测定方法，为各部门人员测定纤维素酶活力提供依据2. 适用范围适用于饲料添加剂的饲料酶产品，也适用于添加有纤维酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料。3. 方法原理纤维素酶从纤维素中分解出还原糖，还原糖又同2羟基一3.5二硝基苯甲酸发生反应，产生一 种黄一橙混合色，可用分光光度法测定其色深。4. 定义在规定条件下，每小时催化底物生成lp mol葡萄糖的酶量定义为一个酶活力单位（p mol / hr）。5. 试剂和溶液5.1磷酸氢二
2、钠一柠檬酸缓冲液溶液 A： 0.2 mol/L NaHPO HO：取 Na HP0 H 0 35.6g 或 Na HP0 12H 0 71.62g,用蒸馏水溶242242242解后定容至1000mL。溶液B： 0.1 mol/L柠檬酸液：取一水柠檬酸（CHOHO） 21.01g，用蒸馏水溶解后定容至10006872mL。溶液C：取A液493 mL，加入507 mL B液混合均匀即为pH4.8磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液。 5.2 DNS试剂取酒石酸钾钠182g，溶于500mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3.5-二硝基水杨酸6.3g， NaOH 2lg，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用
3、蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用，室 温下放置7天后使用。有效期一个半月。5.3羧甲基纤维素钠（CMCNa）溶液取2g羧甲基纤维素钠（粘度300600厘泊）溶于200mL蒸馏水中，水浴加热至溶，用一层纱布过 滤。取滤液100mL，加入PH=4.8磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液20mL，蒸馏水40mL混匀，贮冰箱备用。 一周后应重新配制。5.4 1%标准葡萄糖液精确称取经105C烘至恒重的无水葡萄糖（AR） 1.000g，以蒸馏水溶解，定容于100 mL容量瓶中 制成1%浓度的标准葡萄糖液6. 仪器和设备6.1恒温水浴锅 40 2 C6.2紫外分光光度计UV16016.3电子天平（0.001
4、g）6.4漩涡混合器7. 试验步骤批准日期审核日期编制日期广东溢多利 生物科技股份有限公司纤维素酶 酶活力的测定方法编号:VTR-J-07-3-C/0-05颁发部门：品管部技术标准页码：共2页第2页7.1标准曲线的制作分别吸取1%标准葡萄糖液1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 mL于50 mL容量瓶中，用蒸馏水制成 每mL分别含有葡萄糖200, 400, 600, 800, 1000, 1200p g的标准液。各取不同浓度标准液0.5 mL 于试管中，加PH4.8磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液1.5 mL, DNS试剂3 mL于沸水浴中沸腾7min （样 品放入重新沸腾时算起）
5、，取出后立即加入蒸馏水10 mL混匀，冷却后，在紫外分光光度计550nm 比色，以所得的光密度OD值为横座标，以对应的标准葡萄糖液浓度的二分之一的值（即：100, 200, 300, 400, 500, 600,此为每管中葡萄糖的p g数）为纵座标，绘制标准曲线。空白的制作：以0.5 mL蒸馏水代替0.5 mL标准葡萄糖液，以下操作步骤同标准曲线制作7.2测定步骤待测酶液的制备，精确称取一定量“四分法”采样取得的样品l.OOOg至50mL的试管中，加缓冲液 19mL置于漩涡混合器中震荡至完全溶解，于40 C土 2C的水浴锅浸提60分钟，浸提过程中反复震荡3 4次，浸提后取上清液作为待测酶液。待
6、测酶液用缓冲液稀释到一定倍数（控制测定OD值在0.20.4之间），取经40C预热的此稀释 液0.5毫升，加入经40C预热的CMC液1.5mL （每个样品同时作2 3个不同稀释倍数的梯度，每 个梯度同时作两支平行试管），40C恒温精确反应20分钟，立即加入DNS试剂3mL，立即沸水浴 中煮沸7分钟，终止反应，以下步骤同标准曲线制作。空白制作：取稀释液0.5mL后，先加入DNS试剂3mL，再加入CMC液1.5mL，以下步骤同样 品操作。8.计算r60CMC 酶活力（p mol / hr g 或 u/g）=Xw 20180式中：r 从曲线上查得与标准葡萄糖液相对应葡萄糖微克数。60 1小时=60分钟。1W实际参与反应的酶量即0.5 X稀释倍数（注：稀释倍数为从固体酶粉到最终稀释酶液过程中，每次稀释倍数之积。）20一反应时间，min180为葡萄糖的分子量。注：每个样品同时做的两支平行试管，其相对误差=10%，超过此范围，试验应重做。批准日期审核日期编制日期
