聚合酶链式反应

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1、聚合酶链式反应聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是 生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95。高温时变性会变成单链，低温（经常是 60P左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应 温度（72P左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5-3）的方向合成互补链。基于聚合酶 制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进 行控制。PCR原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径 双链DNA在多种酶的作用下可以变

2、性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。 在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。 因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以 完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶耐热DNA聚合酶-Taq酶可以耐受90C以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成: 模板DNA的变性：模板DNA经

3、加热至93C左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备； 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55C 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72C、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶） 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合 成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链 重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得 更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24 分钟，23

4、小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。反应准备聚合酶链式反应PCR反应体系10X扩增缓冲液10U1P-F0.5ul4种dNTP混合物（终浓度）各 100250 umol/LP-R0.5ul引物（终浓度）各 520umol/LGo Taq 酶5ul模板DNA0.1 2ug模板DNA0.5ulTaq DNA聚合酶510 UH2O3.5ulMg2+ （终浓度）13mmol/L补加双蒸水100 ul其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据 实验调整。PCR反应五要素：引物（PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、 模

5、板和缓冲液（其中需要Mg2+）。PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增 效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不 能太高以免抑制缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或 MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二 价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有 DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构聚合酶链式反应PCR引物设计

6、PCR反应中有两条引物，即5端引物和3引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常 以信息链为基准），5端引物与位于待扩增片段5端上的一小段DNA序列相同；3端引物 与位于待扩增片段3端的一小段DNA序列互补。引物设计的基本原则 引物长度：15-30bp，常用为2Obp左右。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非 特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌吟或嘧啶核苷酸的成串排列参照。 引物内部不应出现互补序列。 两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 端的互补重叠。 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3末端连续8个碱基在

7、待 扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G 和Co 引物的5 端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、 地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。模板的制备PCR的模板可以是DNA，也可以是RNAo模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也 可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS 和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌

8、酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、 氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。聚合酶链式反应反应的控制 PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子关于PCR反应条件控制 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20200umol/L TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul) 引物浓度一般为0.10.5umol/L 反应温度和循环次数变性温度和时间95C, 30s退火温度和时间低于引物Tm值5 C左右，一般在4555C延伸温度和时间72C, 1min/kb(10kb内)Tm 值=4(G+C) +2(A+T)循环次数：一

9、般为2530次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加 循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右， 循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增 加，出现了所谓的“平台期”。PCR reaction volumeName of gRNAR3M3(200ng/ul)R2M2(200ng/ul)Positive control(12)Genome DNA(1 -5ul) (5O-1O0ng】0.60.60.6Primer F (10uM)0.70.70.7Primer R (10uM)0.70.70.7Go

10、Taq555Nucleases-free water to 15ul1. PCR 条件94C2minutesinitial denaturation94 C30sdenaturation57 C20s34 Cycleannealing72 C1minuteextension72C5minutesfinal extension14Cforeverrefrigeration聚合酶链式反应循环参数聚合酶链式反应预变性模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参 考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。聚合酶链式反应变性步骤循环中一般95C, 30秒足以使

11、各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步 骤时间.变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。聚合酶链式反应引物退火退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下 调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。聚合酶链式反应引物延伸引物延伸一般在72C进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时, 本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设 定为 1mi n/kbp。聚合酶链式反应循环数大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。

12、聚合酶链式反应最后延伸在最后一个循环后，反应在72C维持10-30分钟.使引物延伸完全，并使单链产物退 火成双链。聚合酶链式反应步骤标准的PCR过程分为三步：聚合酶链式反应DNA变性(90C-96C)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA聚合酶链式反应退火(60C-65C):系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。聚合酶链式反应延伸(70C-75C):在Taq酶(在72C左右，活性最佳梯度PCR仪)的作用下，以dNTP 为原料，从引物的3端开始以从5-3端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很

13、 短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退 火和延伸同时在60C-65C间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。聚合酶链式反应检测PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素(溴化乙锭，EB)染 色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异 性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法.聚合酶链式反应反应特点聚合酶链式反应特异性强聚合酶链式反应PCR反应的特异性决定因素为： 引物与模板DNA特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保

14、守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对 原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结 合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能 保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。聚合酶链式反应灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12）量级的起始待测模板扩 增到微克（“g=6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。聚合酶

15、链式反应简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液 和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24小时完成扩增反应。扩增产物一般用电 泳分析.聚合酶链式反应纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接 用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。常见问题PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带 型不规则甚至消失。聚合酶链式反应假阴性不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及溴 乙锭的使用，PCR循环条件。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸 变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩