酶工程的发展

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1、酶工程的发展酶工程，从定义上来说，是酶制剂在工业上的大规模应用，主要由酶的生产、 酶的分离纯化、酶的固定化和生物反应器四个部分组成。简而言之，酶工程就是 将酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶 所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社 会生活的一门科学技术。它包括酶制剂的制备，酶的固定化，酶的修饰与改造及 酶的反应器等方面内容。酶工程的前景酶因其反应的专一性，高效性和温和性的特点，已和生物工程，信息科学和 材料科学构成了当今的三大前沿科学。而作为生物工程的重要组成部分，将在未 来的发展中，在世界科技和经济发展中起着主导和支柱作用。而

2、工业用酶日益广 泛地应用于化学，医药，纺织，农业，日化，食品，能源，化妆品以及环保等行 业。据报道，到2003年，欧洲工业用酶的市场增加至9亿美元，年增长率达百 分之十；而2000年的中国，酶制剂总产量达272吨，同比增长8.8%，可谓发展 迅速，前景十分广阔。酶工程的发展酶工程的发展，是一部科学的成长史。在二次世界大战后,酶工程发展成为新 的工业领域酶工程工业。酶工程的发展历史从那时算起, 至今已经三十多个年 头了。六十年代以后, 由于固定化酶、固定化细胞及固定化活细胞的崛起, 使酶 制剂的应用技术面貌一新。七十年代以后，伴随着第二代酶固定化酶及其相 关技术的产生，酶工程才算真正登上了历史舞

3、台。固定化酶正日益成为工业生产 的主力军，在化工医药、轻工食品、环境保护等领域发挥着巨大的作用。几十年 来酶制剂的品种和应用不断扩大。不仅如此，还产生了威力更大的第三代酶，它 是包括辅助因子再生系统在内的固定化多酶系统，它正在成为酶工程应用的主角 近年来, 国际上酶工程技术发展迅速, 硕果累累,主要有基因工程、蛋白质工程 人工合成酶、模拟酶、核酸酶、抗体酶、酶的定向固定化技术、酶化学技术、非 水酶学、糖生物学、糖基转移酶、极端环境微生物和不可培养微生物的新品种等。 以下，将从酶制剂的制备，酶的固定化，酶的修饰与改造及酶反应器的内容展开 酶工程发展现状的描述：酶制剂 ：首先，在生物界中发现的酶已

4、近3000种，而应用于酶工程等领域的约2500种。 小批量生产的商品酶有几百种，大规模生产的有几十种。现已用于工业生产的主 要是：水解酶，凝乳酶，果胶酶，糖苷酶，氧化酶，转移级异构酶等。工业用酶 中60%为蛋白酶（其中洗涤剂用的碱性蛋白酶占 25%；中性蛋白酶占 12%；凝乳 酶占10%；碱性蛋白酶占30%；为碳水化合物的水解酶（其中糖化酶占13%； a 淀粉酶占5% ；葡萄糖异构酶占6%；果胶酶占3%）； 3%为脂肪酶； 10%为医药与 分析研究用酶。六十年代酶制剂的应用, 主要是利用碱性蛋白酶生产洗涤剂。到七十年代已开 始利用葡萄糖异构酶生产高果糖浆和利用淀粉酶生产酒精。八十年代酶制剂则广

5、 泛应用于食品工业，如淀粉加工, 高果糖浆。乳制品、啤酒、葡萄酒、酒精、糖 果, 果汁及调味品的生产, 果汁苦味的去除夕植物产品的抽提等。化学工业，如 造纸、皮革、洗涤剂、氨基酸和漆的生产, 以及纺织业中生丝、麻的脱胶, 棉布 退浆、废水处理等）；医疗卫生领域 如治疗低血压、抗血栓形成、抗癌以及抗生 药物的生产,利用酶测定血糖, 尿素、胆固醇、尿留体激素等）和遗传工程 如利 用限制性内切酶、连接酶及“剪接酶” 开展基因工程研究。酶给人类创造了极 大的社会与经济效益。国外酶制剂发展在国外酶制剂发展中，酶剂发展较快的国家有丹麦、荷兰、美国、日本、西德 和法国等国家。据统计世界各发达国家酶制剂厂的总

6、数约有100家。仅西欧和美 国就有25家, 占三分之一。在25家中, 有9家大公司的产值就占了世界市场的90% 世界著明的酶制剂公司如丹麦的诺沃公司荷兰的吉斯特公司；西德设在美国的迈 耳斯公司都是销售额很大的酶制剂公司。诺沃公司酶制剂销售额占世界市场的44%,吉斯特公司占12%, 迈耳斯公司占8%。国内酶制剂发展对于国内而言，我国酶制剂工业起步较晚, 但近几年来发展迅速。我国于60年 开始建立酶制剂工业。到目前为止 , 全国已有大小200余家酶制剂厂和车间。年 产千吨以上的有3家年产百吨以上的约有20家；其余均为年产数十吨的小厂。生 产的酶制剂总计有13种, 主要是糖化酶、淀粉酶和蛋白酶,还有

7、少量的脂肪酶和葡 萄糖异构酶。1985年全国酶制剂总产量约为2.5万吨, 总产值约1.35万元。其中糖 化酶约4800万吨）, 占总产量的54.6%；蛋白酶约6700吨（其中碱性蛋白酶约为 4800吨，占总产量的27.7%； a淀粉酶4400吨，占总产量的17.7%。酶的固定化酶固定化的现状近来, 国外在探索酶蛋白的固定化技术方面, 已经找到几条途径, 使酶蛋白能 够以有序方式附着在载体的表面, 实现酶的定向固定化, 而使酶活性的损失降低 到最小程度。目前采用的方法有借助化学方法的位点专一性固定化、磷蛋白的位 点专一性固定化、抗体免疫球蛋白的位点专一性固定化、糖蛋白的位点专一性固 定化、利用基

8、因工程的位点专一性固定化。这种有序的、定向固定化技术已经应 用于生物芯片、生物传感器、临床诊断、药物设计、亲和层析以及蛋白质结构和 功能的研究上。而细胞固定化技术、固定化多酶技术及反应器、固定化微生物多酶反应系统、 固定化酶-微生物复合物等技术相继发展起来，酶的固定化是这一发展的基础。 自从固定化酶技术问世以来, 已在很大程度上改变了酶工程的面貌, 固定化微生 物细胞又因其制备简单, 成本低廉以及有一套现成可用的多酶系统, 在许多情况 下显示了比固定化酶有更大的优越性。近年随着分子生物学及生物工程的发展 , 该技术又向动物细胞、植物细胞、杂交瘤细胞以及其他工程细胞扩展, 同时也对 该技术的发展

9、提出许多新的要求。以往报道酶的固定化方法有几百种。切实可行的主要吸附法、包埋法、交联法、 微胶囊法等。其中包埋法是最成功、应用最广泛的方法, 其优点如下：方法简便, 把细胞悬浮物与多聚体或其单体混合, 成胶后即可；固定化条件温和, 因此经常 可以获得高活力的固定化细胞；细胞不漏出；对机械破坏有保护作用；固定化容 量大。酶固定化的进展主要体现在以下几个方面：（ 1 ） 新载体新载体的研制异常活跃如纤维素、淀粉、黄原胶、几丁质、海藻酸盐、壳聚糖、 虾青素、琼脂糖、戊二醛、血纤维原、磁性高分子聚合物、离子交换树脂、水合 氧化钛和膜等。（2）新方法随着天然酶的开发和工程菌的改造 , 传统固定化方法不断

10、被应用到新酶的固 定化研究上, 同时酶固定化技术也不断取得进展, 一些新技术如磁性技术、分子 沉淀技术及辐射技术等不断运用于固定化酶载体的制备。例如内蒙古师范大学邱 光亮等采用共价结合与磁性技术相结合的方法固定化了中性蛋白酶 , 华南理工 大学黄惠华等利用氧化低价铁盐制成磁响应微球固定化了菠萝蛋白酶等 , 葛玉 斌等利用分子沉淀技术固定化了双层葡萄糖异构酶 , 江苏省农科院王延春等利 用低温辐射技术制得一种性能优良的高分子聚合物载体, 固定化了酵母细胞。（3） 新机理酶的固定化技术经过几十年的研究已经发展成为酶定向固定化技术 , 研究表 明已经有几条途径使酶蛋白能够以有序的方式附着在载体表面

11、, 从而避免了酶 蛋白的多点附着引起的无序定向和结构变形, 实现了酶的定向固定化, 使酶活性 损失降低到最小程度。目前采用的方法主要有借助化学、磷蛋白、抗体、糖蛋白 和基因工程的位点专一性固定化等。这种有序的定向固定化技术已广泛用于生物 芯片、生物传感器、生物反应器、临床诊断、药物设计、亲和层析以及蛋白质结 构和功能的研究。综上所述, 由于固定化技术向动物细胞、植物细胞、杂交瘤细胞及工程细胞的 延伸, 不但大大扩展了固定化技术的应用范围 , 同时也促进了固定化技术本身 的变革与提高。酶的遗传修饰与化学修饰：遗传修饰酶的遗传修饰是指人为地将酶基因中个别核苷酸加以修饰或置换 , 改变酶分 子中某个

12、或几个氨基酸, 使酶变得更有利于人类利用。酶的遗传修饰有自然和选 择之分: 前者是指用理化诱变因子作用于活细胞使其基因突变 , 然后从突变体 中筛选有用的个体; 后者是利用基因非定点和定点突变技术, 进行有目的和有 预见的遗传修饰技术, 它是在体外进行基因操作 , 按照预定的目标, 通过核苷 酸的置换、插入或删除获得突变酶基因, 将其移入表达载体获得遗传修饰酶。其 中非定点突变是指那些不能预见确定突变位点的技术 , 常用方法有错误渗入与 修复、化学诱变和寡核苷酸置换等; 定点突变是对已知序列的基因中任意指定位 置进行突变的技术,常用方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突 变及盒式

13、突变等。酶遗传修饰的新进展主要体现在两个方面：( 1) 多位点定点突变技术定点突变是蛋白质工程中采用的重要技术之一 , 但以往一般每次只能引入单 点突变, 突变效率较低, 所以对多点突变技术的研究成为当前的研究热点。例如 复旦大学谢毅等人在寡核苷酸引物介导的定点突变基础上建立了基因的多位点 定点突变法。( 2)酶定向进化技术定点突变和非定点突变技术只能对酶蛋白中某些氨基酸残基进行改造 , 酶蛋 白的高级结构基本维持不变, 对酶功能的改造非常有限。不过如果通过多代遗传 将突变积累起来,就可以较好地拓展酶的功能, 这就是酶定向进化技术。由于微 生物代间期非常短，所以酶的定向进化技术目前备受关注，例

14、如Arnold利用此 技术, 在试管中模拟达尔文进化论的关键过程 , 先进行无序突变和重组, 继而 进行筛选， 再通过多代遗传， 就可以筛选到功能大大改进的酶。酶或蛋白质的定 向进化技术是在蛋白质定点突变技术和蛋白质分子的三维立体结构的计算机辅 助分析技术相互结合和发展下诞生的 ， 这一技术适用于对那些结构已被解析的 蛋白质家族的蛋白质或酶。其利用的主要原理有基因嵌合酶、易错PCR及DNA体 外随机拼接技术。利用酶的定向进化技术对酶基因进行遗传修饰可能获得具有特殊性能的突变 酶， 例如用基因嵌合酶技术获得的儿茶酚 2， 3- 双氧酶不但具有与原酶相同的 催化活性和特异性，而且在高温下更稳定；用

15、易错PCR技术筛选到的一个枯草 芽抱杆菌蛋白酶突变体，催化活性提高了 150倍;Stemmer等利用DNA体外随机 拼接技术改造0-内酰胺酶，获得了一个宿主细胞对头抱霉素抗性提高1600倍的 突变株。多位点定点突变技术和酶定向进化技术是当今酶工程最集中的研究领域， 可以相信将会得到许多性能优异的突变酶菌株。化学修饰酶的化学修饰是指利用化学手段将某些化学物质或基团结合到酶分子上， 或 将酶分子的某部分删除或置换 ， 改变酶的理化性质， 最终达到改变酶的催化性 质的目的。目前修饰剂的选用和修饰方法上有较大进展:( 1) 修饰酶的功能基团， 如氨基、羟基、咪唑基等可离解基团; 有酰化法、烷 基化法、

16、丹磺酰氯法等， 如抗白血病药物天冬酰胺酶， 经修饰后可使其在血浆中 的稳定性提高数倍。( 2) 进行酶分子内或分子间交联， 应用某些双功能试剂分子两端的功能基团如 醛基等可使酶分子内或分子间肽链的两个游离氨基分别发生交联 ， 主要有右旋 糖苷溴化氰法、羰二亚胺法、戊二醛法等。例如交联后的人a-半糖苷酶A,其 热稳定性和抗蛋白酶的性能都有明显增加。( 3) 酶与高分子化合物结合, 主要有聚乙烯醇法、聚顺丁烯二酸酐法等。酶与 高分子化合物结合后, 可以增加酶的稳定性和活力。例如抗白血病药物天冬酰的 游离氨作用、酰化反应进行修饰后, 该酶在血浆中的稳定性有很大提高; 胰凝乳 蛋白酶与水溶性大分子化合物右旋糖苷结合后, 其催化活力提高4倍。常用修饰 剂主要有乙酸酐、氮芥类、磷氧酰氯、环氧丙烷、重氮盐类、羟胺等。酶生物反应器生物反应工程学科是随着生物技术的发展逐步形成的，生物反应工程是一门以 生物学，工程学，计