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1、高速逆流色谱综述高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography，简称 HSCCC), 于 1982 年由美国国立卫生院 Ito 博士研制开发的一种新型的、连续高效的液液分 配色谱技术。该技术由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系 数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附引起的样品损失、失活、变性等问题， 具有传统的液-固色谱所不具备的独特优势，特别适合于天然生物活性成分的分 离。而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大 大提高，是一种理想的制备分离手段，因此此项技术己被广泛应用于中药成分分 离、保健食品、生物
2、化学、生物工程、天然产物化学、有机合成、环境分析等领 域1。1 高速逆流色谱原理 1-2流动相固定相为公转时产生的离心力(內为自转时产生的离心力以WD0转/分的速率进行旋转，在二维力0?为自转轴f A. Fi与內方向一致固定相、流动相分层 与F2方向相反*固定相、流动相混合场的作用下分离管柱内每小时可实现上 万级的萃取过程，从而产生高效的分离图.1高速逆流色谱仪利用螺旋管的自转和公转同步同向行星式运动所产生的变 化离心力场将固定相保留在螺旋管中，允许流动相快速流过螺旋管并与固定相进 行连续高效的混合和分配，达到一种特殊的流体动力学平衡单向流体动力学 平衡，此时在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂都反
3、复进行着混合和静置的分配过 程，这一过程频率极高，在 800rpm 转速下时，混合和分配的频率可以达到 13 次/S。大大提高了两相溶剂的混合效率，可以极大地缩短分离时间，这就是高速 逆流色谱分离效率高的原因。如图.1。2高速逆流色谱（HSCCC）的特点及与制备型高效液相色谱（prep-HPLC）的比 较3-4目前制备出高纯度的天然产物的方法中，制备型高效液相色谱是使用最为广 泛的。与其相比，高速逆流色谱具有以下一些突出的优点。（ 1） HSCCC 回收率高：由于 HSCCC 不需要固体支撑体，避免了样品在分离过 程中的不可逆吸附、分解、变性等问题。理论上，滞留在柱中的样品可以通过多 种洗脱方
4、式予以完全回收；实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。 粗样可以直接上样而不会对柱内固定相造成任何损害。而 prep-HPLC 在样品吸附过程中会出现死吸附的现象，在制备高纯品的过 程中，必然会以牺牲得率为代价，这是prep-HPLC不可避免的。样品回收率低。 而且上样之前需要经过微孔膜过滤，以免堵塞色谱柱。（2）HSCCC 的溶剂系统灵活：溶剂体系是逆流色谱的心脏，它构成逆流色 谱柱的固定相和流动相，通常来说，大部分两相溶剂系统都可以使用，而且可以 通过改变溶剂体系的极性，实现对不同极性物质的分离。而 prep-HPLC 的溶剂系统比较简单，一般多为甲醇-水系统。（3）HSCCC
5、的洗脱方式灵活多样：流动相可以是上相或下相、有机相或水相。 甚至可以使两相溶剂同时双向流动，实现真正连续的逆流色谱过程。还可以实现 多种形式的梯度洗脱过程，如pH梯度、极性梯度等。而 prep-HPLC 的洗脱方式只能为等度或梯度洗脱。（4）HSCCC 制备量大：由于两相溶剂在高速旋转的螺旋管内，可以进行充分、 快速、高效的混和和分配，且固定相的比例较高，使得高速逆流色谱的制备量比 较大，目前实验室规模的逆流色谱制备量可以从几毫克到几十克。这种制备能力 已经与中试级别的prep-HPLC相当，大大超越了实验室规模的prep-HPLC的制 备能力。（5）HSCCC 费用低，因为其不需要昂贵的色谱
6、柱填料。所以主要只需承担试 剂的费用。而 prep-HPLC 由于溶剂系统简单，分离性能的高低很大程度上取决于柱子 的性能。一根性能好的柱子价格是昂贵的。（6）HSCCC 的重复性好：由于不同厂家的设备基本一致，所以实验的重复性 好。而 prep-HPLC 不同厂家的仪器差别较大，而且色谱柱不同，溶剂系统，出 峰时间等都会发生变化。综合来看，HSCCC相比prep-HPLC来说，在天然产物的分离提取与纯化方 面有着巨大的潜力与优势，随着技术的逐渐成熟，其应用前景无疑是广阔的。3 影响高速逆流色谱分离效果的因素（1）固定相的保留值在逆流色谱中，留在管中固定相的量是影响溶质峰分离度的一个重要因素，
7、 高保留量将会大大改进峰分离度。仪器对保留值的影响（外因）：螺旋管支持件的自转半径r与公转半径R之 比 B 值是一个影响两相互不混溶溶剂在旋转螺旋管内保留的关键因素。用大直 径的支持件使值进一步提高，能导致亲水性溶剂体系的单向性流体动力学分布反 向；反之，用小直径的支持件使值减小，能使疏水性溶剂体系的单向性流体运动 方向反向，而介于疏水性和亲水性溶剂之间的中间极性溶剂，其两相分布状况则 会受到离心力条件的影响。溶剂体系物理因素对保留值的影响（内因）：溶剂体系的物理因素如溶剂的黏度对固定相的保留影响很大，低年度的溶剂 体系可望得到高的固定相保留，界面张力和两相间的密度差会对溶剂在临界点附 近的分
8、层时间产生较大的影响，一般为保证固定相保留值合适，溶剂体系的分层 时小于 30s。（2）转速螺旋管的旋转速度对两相溶剂在流体动力学平衡时的体积比，也就是对固定 相的保留值的影响很大，从而影响了分离效果。当然，并不是转速越快越好，一 般对于分配得不是太好的溶剂体系，如两相体系带有氯仿的，还要固定相分层比 较慢的两相体系，通常情况下转速越高，越易产生乳化现象。（3）流速流动相流速也会影响两相的分布，一般情况下，流动相流速越大，固定相流 失加重，但流速过慢会导致分离时间过长，从而造成对溶剂的浪费。（4）温度温度的提高溶剂的黏度有很大的影响，一般提高温度会获得高的保留值，而 相反降低温度则得到低的保留
9、值，但一般温度不可能提高太多，因为所用的都是 有机溶剂，沸点很低。4高速逆流色谱的发展一pH区带逆流色谱5-6高速逆流色谱可以分离多类物质，包括黄酮类、萜类、苯丙素类、多酚类以 及生物碱等，但在分离一些结构相近的物质是，很难选择到合适的溶剂系统将其 分离开。pH 区带精制逆流色谱最早是在普通制备型高速逆流色谱的基础上发展起来 的。利用取代色谱的特点，由一系列的溶质区带组成，样品在区带之间的界面富 集，杂质则在区带的边缘。这种技术需要在有机相中加入有机酸或碱，水相中加 入无机反离子。有机相和水相都可以作为流动相或固定相。当流动相穿入固定相 时，由于酸碱反应，最终达到平衡。有机酸在有机相和固定相中
10、的分配系数作为 量度，样品的分配系数与其的差距决定各样品的出峰时间。当样品进入柱中时被 分离物质便以一串矩形峰的形式被洗脱出来，并且依据 pKa 和疏水性所决定的 pH值的大小依次排开。同普通的高速逆流色谱相比，pH区带精制逆流色谱具有 分离容量大、分离纯度和效率高等优点。特别适用于分离那些在较宽的pH 1 10 内，可形成稳定的可离子化的物质。5 pH区带精制逆流色谱分离制备苦参中生物碱苦参是一种传统的中药，在中国被用于治疗多种疾病，如：解热剂，利尿剂， 驱虫剂和解毒药。苦参的根中含有超过 10 种的生物碱，它们之中槐果碱和苦参 碱是治疗癌症的主要有效成分。但这二者结构性质相近，在分离时，普
11、通的方法 难以取得良好的效果。利用pH区带精制逆流色谱，通过对其溶剂体系和其他一 系列条件的摸索，可以将其很好的分离。分离步骤为：每次分离前，柱子都要用有机固定相填满。之后，样品溶液通过进样口注射如系统，水相作为流动相用泵打入柱，流速1.5 ml/min,柱转速800 rpm。从柱出口流出的洗脱液通过紫外检测器254 nm波长处和pH检测器连续监 测。结果如下图 2。图.2A呈现了一个典型的pH区带精制逆流色谱图，色谱图来自苦参中提取 的1.0 g生物碱粗品的分离。分离得到两种纯的生物碱：来自峰I的苦参碱（图.2 中I）和来自峰II的槐果碱（图.2中II）。峰I呈现了一种标准的高斯形状，它 不
12、受流动相pH的影响。同时，峰II洗脱成标准的矩形形状，这与平坦的pH区 带后pH的急剧下降是一致的，但峰II的尾部与一个杂质峰（1-2m 1）相连。图.2B呈现了一个在相同实验条件下，分离从苦参中提取的相同的生物碱粗 品2.0 g,得到了一个相似的色谱图。增大样品的质量，导致了两个峰的加宽，分辨率的降低。图.2C呈现了在pH区带逆 流色谱的流动相 HCL 浓度变低 的情况下，分离从苦参中提取的 相同的生物碱粗品1.0 g,得到 的色谱图。在流动相中减少洗脱 剂中酸的浓度，导致洗脱峰II的 形状发生了一个明显的变化,峰 II变的更宽，矩形的形状也发生 变形,而且与杂质峰完全分离。 纯的生物碱分别
13、从两个峰中被 分离出来：苦参碱（600 mg）和 槐果碱（170 mg）纯度都超过 98%。Trsz) H0MV8HOS9V8U bsz)(mu bsz) HONVHHOSAV图.2随着 HSCCC 技术的发展和中药现代化速度的加快, HSCCC 技术必将成为 分析和制备天然产物活性成分的一种重要手段,其将在新药开发、成分研究、指 纹图谱的建立以及标准品的制备等方面得到更为广泛的应用。6 参考文献1 辛莉等,高速逆流色谱以及其在天然产物分离中的研究进展,食品工业科技,2009（11）：235-2382 曹学丽等，逆流色谱技术及其在食品领域的应用进展，北京工商大学学报， 2010,28（3）：6
14、-113 侯志国等，高速逆流色谱联用技术应用于天然产物的研究进展，中国天然药 物，2010.8（1）：62-674 郭丽丽等，高速逆流色谱实验在有效成分分离中溶剂体系的选择 ， 2010.5:27-29缪维芳等，pH-区带精制逆流色谱的研究与应用，科技论坛 黄 娟等，pH区带精制逆流色谱在中药中的研究进展，中草药，2007.38 （2）7 Fuquan Yang ， Preparative separation of alkaloids from the root of Sophora-avescens Ait by pH-zone-refining counter-current chromatography， ournal of Chromatography A,822（1998）316 -20生研 1005 周沫 2010001272
