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1、细胞转染讨论最好同时设计几对，选择效果较好的，别忘了做对照（GFP），排除非特异性干预1.不同的细胞及转染试剂对于质粒和脂质体的比例要求是不同的，所以在正式实验前必须摸索一个最佳转染比例。总的来说，细胞系较原代好转，脂 质体的用量以说明书为参考上下浮动。2.对于转染后的效应检测，体外直接合成的SiRNA多半在48h检测，也有72H的，但时间再长有可能降解而失去功效。 对于用U6或H1质粒载体体内转录生成siRNA的，因为有一个转录时间，所以检测可以稍靠后；而且，与体外合成的相比，虽然载体也不能大量整合到细胞 基因组中，但毕竟不会马上降解， Knockdown 的时间效应相对要长，一般一周左右没
2、有问题。所以可以在检测时做一个时间梯度，使实验数据更加丰满完善一 些。（但要考虑靶细胞生长特性，疯长的可能效果较差）一般在转染后46小时补加血清，可以就在你原来的无血清培养基中滴两滴血清。如果你觉得LF2000可能对你的细胞有毒性作用的话（一般LF2000 的毒性不至于很大，可以不用更换培养基，具体看你细胞的生成状态了），你可以把原来的无血清培养基吸出来，更换成含血清的培养基。 在转染后的 46 小时，最好不要动你的细胞，让它安静地躺着，因为此时细胞最为脆弱，不合适的动荡会使其死亡率增加。lipofectamine2000 转染后在 6 小时左右最好换液且换为有血清的血清，其一因为 lipof
3、ectamine2000 对细胞的毒性作用还是有的，其二可降低因血清 的缺乏引起的细胞的死亡。转染时不加血清是防止血清的干扰作用，转染后可适时加入。加入过早会引起未转染细胞的优势生长，过晚会引起较多细胞死亡。 可时时观察1/5细胞变圆的时候加入血清。转染全程都不应加有抗生素的，我刚刚做完LP2000转染的，把我的一点经验告诉你啊：1.加完脂质体DNA混合物后细胞就出现小黑点，这很正常 的，因为LP2000即使毒性再小它也是有毒性的，减轻的办法就是45小时把混合物去掉换有血清的新培养基培养，我做之前看有些战友的意见毒性大3小时 换也行的。2.我的是在无血清的DMEM下转的，推荐买OPTI-MEM
4、,但到货一个月，我也没用，不过还可以的3.多摸几个浓度比例，找出最适合的，如果有 报告基因就最好了，但是我的也没有。4.细胞密度要够哇，80%左右吧，我感觉细胞死的还挺多的。5.按照LP2000操作说明来做，基本上没问题的。6.这 个我应该建议你在做之前搜索本版，好好看看战友的经验，绝对受益匪浅啊RT-PCR检测转染提取RNA中混杂有少量质粒DNA会出现RT-PCR假阳性。排除方法：设一阴性对照，用提取的RNA （不经RT）直接作模板进行PCR扩增。我准备研究某基因功能，构建了重组表达质粒（以荧光素酶为报告）.现准备转染细胞，并以不含目的基因的质粒作对照。请问：1.如果以beta-gal质 粒
5、共转染作内参，荧光素酶活性如何校正？ 2.如果以 beta-gal 质粒共转染作内参，各种条件转染需作复孔吗？ 3.各种条件转染均作复孔，结果经统计学处理， 目的是排除孔间转染效率差异。是否还需要作共转染内参照？为了简便，大多数的研究者，如楼上所说，把LUCIFERASE的活性值除以beta-gal的值就行了。但理论上讲是应该将内源性的beta-Gal活性扣除的， 对于哺乳细胞，内部是有此酶活性表达的。所以，要设一个孔，任何DNA都不转染，然后把所有的beta-gal活性值都减去这个阴性对照的数值，最后把这个 值与LUCIFERASE的活性做比，求出的比值为LUCIFERASE基因前面PROM
6、OTER的活性。PROMEGA有一种试剂盒，做内参照的不用beta-gal，是另一 种LUCIFERASE，用不同的底物。这种酶在细胞内没有内源性的表达，结果更可靠些。这个beta-gal 一定要加，因为它是衡量转染效率的。它可是告诉你， 是十个DNA转进去了，还是一百个。如果没有这个衡量标准，转进去了一百个DNA的LUCI活性当然强，如果跟转进去十个的比高不了多少，那事实上LUCI 前的PROMOTER活性还是低。如果没有这个标准就会得出错误的结论了。减去背景beta-Gal的时候不可直接减，要换成（活性/毫克）再减，这样相当于每 个细胞里减去背景。同样的道理，做比值的时候也要把A值换成（活
7、性/毫克）再与beta-Gal比。不知说明白了没有。总之感觉处理数据很困难。总体的趋势 应该和两值直接比差别不大（在背景比较小的时候。有的细胞背景就是高）。有两种可能，一是 LIPO 对你的细胞毒性大，解决方法是五小时转染完成后，把转染混合液吸出，再加培养液。二是该细胞对你转染进去的质粒表达 产物敏感，或是被诱导了 APOPTOSIS，或是造成了 DIFFERENTIATION，解决方法是换一种细胞，看这种现象是否发生MTT检测的是细胞的活性，即活细胞数的相对量，不可能用来检测转染效率.MTT检测最后细胞都碎裂，如何继续培养.可做三个平行孔，分别24.48 72小时 检测.想做Western
8、和, RT-PCR和流式的话，如果这些孔转染相同的质粒，当然可从其中几个孔的细胞做Western,再取另外几个孔的细胞作RT-PCR，再取别 的孔的细胞作流式？其实瞬转质粒的效果都不好,建议还是做稳定表达.可考虑以下原因： 1.培养基必须在转染24小时前换用无双抗的。 2.质粒虽然是按说明书提取的，但要看清楚质粒提取试剂盒是否可以去除内毒素。 3.如果选用 Invitrogen Lipofectamine 2000，它提供的参考步骤并不一定是你选用的培养板规格，须参照后面的列表 4.培养板非常容易污染，必须排除微生 物污染的可能 5.可以考虑转染 5 小时左右吸去转染液体，换用含血清的培养基继
9、续培养 6.转染前你培养了多少时间？如果进行顺式转染，必须在细胞生长达到7 0 80%再进行转染个人认为你还可 以考虑以下方面： 1.请确认你的 Lipofectamine 2000 是否已经过期，经过我们实验室的实践：尽量使用开封半年内的 Lipofectamine 2000，因为过了半年后，就算没有过失效期，但是细胞毒性大大增加，而转染效率却大大下降。 2.确认你在使用 Promega 质粒提取试剂盒是使 用了内毒素去除树脂（Endotoxin Removal Resin）。3.按照Promega质粒提取试剂盒的protocol，在第19步加入nuclease-free water后直接放
10、入-20或-80 度冻存就可以，我们没有另外沉淀。4去除质粒提取中的酒精可以试用下面的方法：将Ep管倒置在灭菌的滤纸上，大概10-20分钟后就可以干了，注意不要 时间过长，否则太干了，不太好溶解。5你可以尝试适当减低转染试剂的用量，并在转染5小时时观察细胞情况，并且换10%FBS的培养基，看看情况怎么 样，因为转染液对细胞的损伤非常大。 祝您实验成功！各种培养细胞或细胞株对转染试剂的毒性敏感程度不一样, 脂质体的毒性大一些, 如果是转染试剂的问题,建议使用毒性低一些的转染试剂,如阳离子聚 合物转染试剂，可以试试梭华-sofast。http:/ 1.高质量的 siRNA（或者是 siRNA 表达
11、工具，比如质粒，PCR 片断等）2.有效的转 染试剂。 如何选择最适合的转染试剂和转染条件，往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。常见的转染试剂包括脂质体和多胺类的试剂，主要 是为双链DNA转染而设计的。转染质粒DNA的最佳试剂往往不适合siRNA的转染，反之亦然。适合于质粒DNA转染用的转染试剂往往也不适合siRNA表达 框（SECs: PCR fragments expressing siRNAs，参考RNAi：制备siRNAs的5种方法如何选择最适合你的方法）的转染。随着RNAi技术越来越受重视，各厂家纷纷推岀了自己的RNAi转染试剂。一：siRNA专用转染试剂（二：质粒和P
12、CR片断专用转染试剂）产品名：RNAiFect Transfection Reagent厂家： Qiagen优点：高效低毒；适用细胞广泛；即用型试剂，可在含有抗生素的完全培养基中转染，操作格外简单方便简介：siRNA的转染是基因沉默实验中关键 的一步。RNAiFect是一种基于脂质的转染试剂，专门用于siRNA转染，确保没有RNAse活性。传统的转染试剂有一定的细胞毒性，在转染过程由于提高细胞 的通透性因而不能在培养基中添加抗生素。由于RNAiFect的内毒素和细胞毒性都非常之低，加上转染复合物能够高效的在完全培养基中形成，因而整个转染 过程可以在含血清而且是含有抗生素的培养基中操作，无需更换
13、培养基，这极大的方便转染操作！该试剂可以耐受较高浓度的siRNA转染而不引起细胞毒性， 能够得到更好的抑制效果，适用于包括AGS, HEK-293, HeLaS3, Huh-7, HUVEC, NIH-3T3, and mouse embryonic fibroblasts cells在内的多种真核细胞。操 作流程：1用含有抗生素和血清的培养基，或者是附带的Buffer EC-R稀释siRNA 2加入RNAiFect转染试剂，在室温下混合并孵育1015分钟3加入培 养细胞中即可。2448小时后检测siRNA的干扰效果。参考数据：HeLa-S3 cells were plated out in
14、24-well plates at a density of 6 x 104 cells in each well, 24 hours after transfection. Cells were transfected with lamin A/C si RNA using the transfection reagents indicated, according to the manufacturers protocol. mRNA was purified from the cells 48 hours after transfection and q uantitative RT-P
15、CR was performed using the QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit with primers targeted to lamin A/C and GAPDH. Expression of the lamin A/C gene was normalized to the expression of GAPDH and quantified using a standard curve prepared from known amounts of cDNA purified from HeLa-S3 cells. Cells were trans
16、fected and LDH activity in the cell culture supernatants was tested 48 hours later, using a colorimetric assay according to the manufa cturers protocol. LDH activity in the cell culture supernatant of untransfected cells lysed by detergent was set to 100%. Background LDH activity was measu red in untransfected and untreated cells, and this value was subtracted from all other measurements. Name
