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1、一、基因编辑的概念基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定位到基因 组的某一位点上， 在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因 的自然突变， 又修改并编辑了原有的基因组，真正达成了“编辑基因” 。目前主要有 3 种基因 编辑技术，分别为：a)人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases, ZFN)技术；b)转 录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases， TALEN)技术；c) RNA 引 导 的 CRISPR- Cas 核 酸
2、 酶 技 术 (clustered regulatory interspaced short palindromic repeat /Cas-based RNA-guided DNA endonucleases， CRISPR/Cas )。二、 三种基因编辑技术的介绍1.ZFN 基因编辑技术ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的 DNA 序列识别的锌指蛋 白发展起来的oZFN由特异性识别序列的锌指蛋白(ZFP)和FokI核酸内切酶组成。其中，由ZFP 构成的DNA识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokI构成的切割域能执行剪切功能，两 者结合可使靶位点的双链DNA断
3、裂(DSB)o于是，细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非 同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复DNAo HR修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插 入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因 敲除的目的。2.TALEN 基因编辑技术TALE (Transcription activator -like effectors):一种源于植物致病菌 Xanthomonas sp.的靶向 基因操作技术。 TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE array 与 FokI 融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正
4、义链上靶标位点, 另一个则靶向反义链上的靶标位点. 然后 Fok I形成二聚体，在靶向序列中间的spacer处切割DNA,造成双链DNA断裂，随后细胞启 动DNA损伤修复机制.针对不同的TALEN骨架，其最适宜的spacer长度不同，其长度范围一 般为1220 bp.实验结果表明,TALENs在靶向DNA时，第一个碱基为T时其结合效果更佳。3. CRISPR/Cas9 基因组编辑技术CRISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与 sgRNA 构成. 转录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构 后与 Cas9 蛋白形成复合体， 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点 ， 在 PAM 序列
5、上游处 切割 DNA 造成双链 DNA 断裂， 并启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的 CRISPR/Cas系统，其CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)靶向序列的长度不同，PAM序列也可 能不同。最新报道，CRISPR-C2c2系统能够根据靶向序列特异地编辑单链RNAo三、-WORD格式-可编辑-专业资料,三种编辑技术的比较1.共同点结构的相似性：无论是ZFN、TALEN还是CRISPR /Cas9,都是由DNA识别域和核酸内切 酶两部分组成。其中ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA，而TALEN的DNA识别区 域是重复可变双残基的重复, DNA 剪切区域都是一种名为 F
6、okl 的核酸内切酶结构域。 CRISPR 的DNA识别区域是crRNA或向导RNA，Cas9蛋白负责DNA的剪切。当DNA结合域识别靶点 DNA序列后，核酸内切酶或Cas9蛋白将DNA剪切，靶DNA双链断裂，再启动DNA损伤修复 机制，实现基因敲除、插入等。作用过程的相似性：通过DNA识别模块对特异性的DNA位点识别并结合，然后在相关 核酸内切酶的作用下完成特定位点的剪切，从而借助于细胞内固有的HDR （同源定向修复）或 NHEJ （非同源末端连接）途径修复过程完成特定序列的插入、删除及基因融合。2.不同点二种基因编辑技术的差异ZFNTALENCRISRP系统识别模式蛋白质一DNA蛋白质一D
7、NARNADNA靶向元件ZF array 蛋白TALE array 蛋白sgRNA蛋白切割元件Fok I蛋白Fok I蛋白Cas9蛋白识别长度(3-6) x 3 x 2 bp(12-20) x 2 bp20 bp识别序列特点以3 bp为单位5 前一位为T3 序列为NGC优点平台成熟、效率高于 被动同源重组设计较ZFN简单、特 异性高靶向精确、脱靶率低、 细胞毒性低、廉价缺点设计依赖上下游序 列、脱靶率咼、具有 细胞毒性细胞毒性、模块组装 过程繁琐、需要大量 测序工作、一般大型 公司才有能力开展、 成本高靶区前无PAM则不 能切割、特异性不咼、 NHEJ依然会产生随 机毒性能否编辑RNA不可以不可以可以
