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1、-总RNA的提取Trizol法提取在收集到生物材料之后，最好能即刻进展RNA制备工作。假设需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以参加液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以防止RNase的作用。1. 提取组织RNA时，每50100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进展裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温1530C下放置5分钟；3. 在上述EP管中，按照每1ml TR
2、IZOL加0.2ml氯仿的量参加氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下1530放置23分钟后，12000g28离心15分钟；4. 取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量参加异丙醇，在室温下1530放置10分钟,12000g28离心10分钟；5. 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进展洗涤，涡旋混合，7500g28离心5分钟，弃上清；6. 让沉淀的RNA在室温下自然枯燥；7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。 PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa E*TaqTM和Pyr
3、obestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱廉价，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa E*TaqTM是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3端附有一个A碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进展基因的扩增请使用此酶。1. 按以下组成在PCR反响管中调制反响液：TaKaRa Taq
4、TM或TaKaRa E*TaqTM的配方ReagentQuantity, for 50l of reaction mi*ture10* PCR buffer Mg2+ free5 lMgCl225mM如TaKaRa TaqTM加3 l 如TaKaRa E*TaqTM加4 l2.5mM dNTP mi*4 l 10M Primer 上游1 l10M Primer下游1 lTemplate DNA1 lTaq或E*TaqDNA Polymerase0.25 lSterile deionized waterUp to 50lTotal50 l /SamplePyrobestTM DNA Polyme
5、rase的配方ReagentQuantity, for 50l of reaction mi*ture10* Pyrobest buffer 5l2.5mM dNTP mi*4l 10M Primer上游1l10M Primer 下游1lTemplate DNA1lPyrobestTM DNA Polymerase0.25lSterile deionized waterUp to 50lTotal50l /Sample 反响总体积根据实际情况进展调控，可以做2050l以节约试剂； 将上表各成分参加到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中； 如果不用PCR仪的加热盖，在反响混合液的上层加30
6、 50l 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；2. 按以下程序进展PCR扩增。PCR反响条件视模板、引物等的构造条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进展优化。StepTemperature, C Time, minNumber of cyclesNote起始变性94951-31变性94950.5-225-35退火温度比理论退火温度大概低5C，再根据反响结果优化退火37-700.5-2延伸70-75根据扩增产物的大小每分钟延伸1000bp最终延伸70-75101反响完毕后，抽取扩增样品5l，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存
7、，以备以后分析使用。RT-PCRProtocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)1. 按以下组成在PCR反响管中调制反响液ReagentQuantity, for 50lof reaction mi*ture10One Step RNA PCR Buffer5l25 mM MgCl210l10 mM dNTP mi*5lRNase Inhibitor (40 U/l)1lAMV-Optimized Taq1lAMV RTase *L (5 U/l)1l上游特异Primer (20 M)1l下游特异Primer (20 M)1l实验样品RNA1 g Tota
8、l RNA1lRNase Free dH2O24lTotal50l /Sample1. 反响总体积根据实际情况进展调控，可以做2050l以节约试剂；2. 将上表各成分参加到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；3. 如果不用PCR仪的加热盖，在反响混合液的上层加30 50l 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；2 按以下条件进展反响StepTemperature, CTime, minNumber of cyclesNote逆转录50301逆转录酶失活9421变性940.525-35退火37-650.5退火温度比理论退火温度大概低5C，再根据反响结果优化延伸72根据扩增产物的大小Taq
9、酶每分钟延伸1000bp最终延伸72101反响完毕后，抽取扩增样品5l，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。琼脂糖核酸电泳1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；2. 根据欲别离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，参加到配胶用的三角烧瓶内，定量参加电泳缓冲液一般2030 ml；3. 放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，参加一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；4. 室温下3045分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽
10、内；5. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；6. 在DNA样品中参加10体积的载样缓冲液loading buffer，混匀后，用枪将样品混合液缓慢参加被浸没的凝胶加样孔内；7. 接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60100V电压，电泳2040min即可；8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；9. 电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比拟被扩增产物的大小。 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最正确分辨范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最正确分
11、辨范围bp0.5%1,00030,0000.7%80012,0001.0%50010,0001.2%4007,0001.5%2003,0002.0%502,000胶回收纯化DNA1. 琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；2. 按照每100mg加400l的量参加binding buffer，放入到EP管振荡器中，4555温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解大概要5分钟；3. 取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2分钟，8,000rpm 离心1分钟，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；4. 加500l的wash buffer至柱中，8,000rpm 离心1分钟。弃管中的溶液；5. 重复操作4步的操作1次，最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒，除去痕量的wash buffer；6. 将纯化柱放入一个新的EP管。加3040l H2O或者elution buffer至纯化柱膜的中央，在37或50下放置2分钟，10,000rpm离心1分钟洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在-20保存。7. 注：假设想要不电泳而直接纯化DNA溶液，只需要在第2步中按100l液量加400l的binding buffer,其余的步骤不变。. z.
