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1、目的基因转移的方法1、受精卵雄原核显微注射法2、胚胎干细胞（ES细胞）法3、逆转录病毒感染法4、体细胞核移植法5、精子载体法6、YAC法7、BAC法1、受精卵雄原核显微注射法 以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继 续发育获得转基因动物个体/ 优点：转基因速度快转基因的长度也没有严格限制，不经嵌合体途径便有可能直接获得纯系，实验周期短，适用的动物物种广泛/ 缺点：转基因的整合是随机的，整合的位点、拷贝等均难以精确控制，可造成较严重的插入突变2、胚胎干细胞（ES细胞）法胚胎干细胞（embryonic stem
2、cell，ES细胞）是从胚泡内细胞团分离得到的多潜能细胞。将外源基因导入体外培养的ES细胞，经筛选后获得整合稳定和表现良好的细胞，将这些细胞注射到小鼠胚泡腔中，部分ES细胞可与内细胞团融合并参 与其分化，形成嵌合体。在嵌合过程中，带有外源基因的ES细胞可能进入生殖系，在经杂交育种可得到纯合体，即为所需的转基因小鼠。 基因打靶载体的构建；ES细胞的DNA转染；基因剔除小鼠阳性细胞克隆的筛选；ES细胞的囊胚注射和胚胎移植；嵌合小鼠及剔除杂合 子小鼠的获得；纯合小鼠的获得及表型研究ES细胞的DNA转染：逆转录病毒感染，脂质体介导，电穿孔，磷酸钙共沉淀 基因打靶的简易程序：1ES划医聘选ES華屜申的林
3、干剧用理国工輕方吿囱1!勿離功総元伴.多采用电曲击法把ES肃會子朝薔注人聃主懸賣申罐10-20牛廳聃转僭別 惶孕就子窖中优点:外源基因整合情况的可控性高:可预先样，细胞鉴定及筛选方便在细胞水平检测外源基因的,拷贝数、定位?表达的水平及插入的稳定性 匕烁h 氐u疏fRNA印遲棗交）勺稳定性；外源基因导入ES细胞的方法多缺点：ES细胞系建立及培养困难；维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易；所得个体为嵌合体。3、逆转录病毒赢法.-主要是利用反转录病毒的长末端重复序列（LTR）区域具有转录启动子活性的特点，将外源基因连接到LTR下游进行基因重组后，再包装成为高滴度病毒颗 粒，去直接感染受精卵或显微注
4、入囊胚腔中，携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。优点 由于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA中的高度整合特性，大大提高基因转移的效率。细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载 至细菌中扩增和表达。病毒载体是较理想的真核基因工程载体缺点1获得纯合体的转基因动物的机会少2病毒载体构建复杂3转入的外源基因的大小受到限制, 减少受体动物的数目，不需要用受体母畜来承担那些非转基因的胚胎，表现了强大的生命力。事先在细胞中进行基因转移和对阳性细胞进行筛选 简化了转基因动物生产的许多环节,节约了人力,具有很大的优越性。缺点 体细胞克隆技术近年来发展势头十分迅猛，但在基础理论和实验技术上还
5、需进一步探索。5、精子载体法/ 将精子与外源DNA进行预培养之后，使精子有能力携带外源基因进入卵中,受精后进行胚胎移植，这样产生的动物也会使外源基因得到表达。/ 精子携带DNA的途径：（外源DNA与精子共孵育；电穿孔导入法；脂质体转染法 优点：基因转化方法简便,效率高,动物育种不经过嵌合体,实验周期短 缺点：目的基因整合的随机性,无法早期验证修饰事件,成功率不高、效果不稳定6、YAC法（人工酵母染色体法）优点：克隆百万碱基对（Mbp）级的大片段外源DNA的能力，可以保证巨大基因的完整性； 保证所有顺式作用因子的完整并与结构基因的位置关系不变;；保证较长的外源基因片段在转基因动物研究中整合率的提
6、高; ；鉴于基因的完整性,目的基 因上下游的侧翼序列可以消除或减弱基因整合的位置效率。缺点：不稳定,制备工艺繁琐。7、BAC法（人工细菌染色体法）建立在大肠杆菌的F因子上的BAC载体：外源DNA可300kb。F因子（F质粒）是一种“性质粒”，可转移至F-宿主细胞。100kb，近百个蛋白质。1;可构建BAC文库；2；有单一的loxp位点，利于图谱分析（借助标记loxp和ere重组酶；3； BAC载体两端有Sp6和T7引物序列利于测序，确定基因的染色体定位； 4；可稳定遗传，易于操作。BAC文库：基因组酶切后100300kbDNA+BAC 大肠杆菌方法显微注射核移植胚胎干细胞逆转录病毒基因敲除精子
7、介导优点外源基因整合效率较 高，不需要载体，目的 基因的长度可达100Kb转基因效率高；预测 基因表达水平；可以 使用定点整合技术外源DNA的整合率 高；整合在生殖细 胞中的比例也很高。可在整合点整合转移基因的单个拷贝；该方法简单、方便缺点精密仪器，技术操作较难，易造成宿主动物基因组的插入突变供体细胞易衰老ES细胞株不易建 立，长期培养后出现 分化现象；生产的转 基因动物都是嵌合 体插入的基因有大小 限度；嵌合性很高； 外源DNA在动物 各种组织中的分布 不均应用具有一定局限性有些结果不能重复RNAi原理：【siRNA （small interfering RNAs）即为能够以同源互补序列的m
8、RNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链RNA分子】 /当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。/ 识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先有义链的位置。/ 核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了 21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割,从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。RNAi研究的一
9、般技术路线艇目的基因化学合成1； 从NA寻找“ AA”设计SiRNA的茅列抚得SiRNARNAi设计-悴夕唏录siRNA姦达静列，并记卜其3siRNAted regions，L19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点2； GC含量在30%50%左右3；不要针对5和3端的非编码区（untr始复合物可能会影响1RNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果4；将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起制备RNAi等等码序列/EST同源的序列5；通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列1;化
10、学合成2；体外转录3； RNAase III降解dsRNA，4； siRNA表达载体5； PCR表达框RNAi的效果分析：/ mRNA： RT-PCR 定量 PCR； Northern 杂交等（8-48h）/ 蛋白质：Western杂交；ELISA；免疫荧光等（48h-72h）/细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变化是RNAi效果最终和最大的体现RNAi文库：人工构建的能通过诱导沉默众多不同基因表达的组合文库，可以用于建立功能缺陷（loss of function）的生物或细胞库，进行表型的筛选 转基因小鼠技术概念: 将外源基因导入到组织细胞内，且导入的基因可以通过遗传给后代，并发挥作用
11、的过程。转基因小鼠概念: 转基因小鼠是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳定表达的一类动物。（包括基因敲除的动物） 小鼠的生物学特征:小鼠与人的相似性极高；解剖学形态和生理学稳态；生殖行为和疾病的病机；遗传学的可操作性，可干预性 小鼠基因组测序已完成93%的基因组序列和90%的人基因组序；列可归入保守的同线性片段，二者编码的蛋白质基因数目均为3万左右 小鼠作为模式生物的优势与人极相似的哺乳动物；生育周期短1820d ；繁殖能力强；遗传背景清楚、品系较齐全；小鼠基因组测序已完成 转基因动物的构建程序:1；选择、纯化和克隆目的基因2；含外源基因的重组载体的构建3；目的基因向生殖细胞/胚胎干细胞的转移4；含外源基因的受精卵或早期胚胎发育和 表达 5；筛选所需的稳定的转基因动物品系/目的基因的获得;；逆转录合成法；化学合成法；PCR扩增法/目的基因的扩增;；通过载体在宿主中克隆 通过PCR扩增目的基因Screening Strategies:1； Southern blot。 2； PCR/RT-PCR。 3；其成功率的高低主要取决于受精卵和胚胎发育的时间4；基因的整合是随机的，多数插入单一染色体位点中。外 源基因的插入会引起宿主基因的 DNA 序列重排，缺失，重复或易位。
