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1、细胞生物学实验生命科学学院生物技术系二O一0年目 录实验一：特殊显微镜的原理及其使用 4实验二：电子显微镜的原理及使用 8实验三：细胞膜的渗透性 18实验四：细胞的凝集反应 20实验五：诱导细胞融合聚乙二醇法 23实验六：线粒体和液泡系的超活染色 26实验七：叶绿体和细胞核的荧光观察 29实验八：细胞骨架的观察 31实验九：细胞中DNA、RNA的显示 33实验一 特殊显微镜的原理及其使用I.暗视野显微镜的原理和使用一、实验目的1.了解暗视野显微镜观察活细胞的基本原理；2.了解暗视野显微镜的特殊组件和位置；3.掌握调节暗视野显微镜的基本步骤。二、原理和结构特点在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不
2、易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。暗视野显微镜就是利用此原理设计的。它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视野聚光器，常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像并非物体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于1/2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。一般暗视野显微镜虽看不
3、清物体的细微结构，但却可分辨0.004m以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2m)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。三、仪器、材料与试剂（一） 仪器具有暗视野聚光器的显微镜（二） 材料牙垢微生物，洋葱内表皮细胞，载玻片，盖玻片，牙签，尖头镊子，滤纸条，指甲油，擦镜纸等。（三） 试剂生理盐水四、实验步骤1.样品制备：在一张无划痕、清洁的载玻片上滴一滴生理盐水，用牙签取牙垢或用镊子撕洋葱内表皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀，盖上一片无划痕、清洁的盖玻片，用滤纸条吸取盖片四周多余的水分，用指甲油封片（或不封片）。2.将暗视野聚光器安装在显微镜上，调强
4、照明光。3.将标本置于载物台上，插入10x物镜，用调焦螺旋聚焦样品。4.调节暗视野聚光器位置：这一步是调节暗视野像的关键，包括调节暗视野聚光器的高低位置和中间位置。可反复、缓慢地由低到高或由高到低调节暗视野聚光器的高低位置，聚光器偏高或偏低都将在视野中出现质量不好的影像，只有在合适的位置时，才可出现背景暗、影像亮的暗视野效果；调好聚光器的高低位置后，再通过聚光器上的调中螺旋调节聚光器的中心位置，使得到最好的暗视野像效果。5.换用高倍物镜观察时，要换用高倍物镜相匹配的暗视野聚光器，依据上述步骤进行调节。五、作业1.绘制暗视野内牙垢微生物、洋葱内表皮细胞图（35个细胞）2.明视野和暗视野像的主要区
5、别是什么？暗视野显微镜的特殊组件是什么？II.相差显微镜的原理和使用一、实验目的1.了解相差显微镜观察活细胞的基本原理；2.了解相差显微镜的特殊组件和位置；3.掌握调节相差显微镜的基本步骤。二、原理和结构特点光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达到的位置)的不同。当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化(相应发生的差异即相差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下
6、难以观察到。相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差(明暗差)，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。 相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜(通常标有PH的标记)代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。相板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。
7、调轴望远镜是用来进行合铀调节的。相差显微镜在使用时，聚光镜下面环f状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。三、仪器、材料与试剂（一） 仪器相差显微镜（二） 材料口腔上皮细胞，洋葱内表皮细胞，载玻片，盖玻片，牙签，尖头镊子，滤纸条，指甲油，擦镜纸等。（三） 试剂生理盐水四、实验步骤1.样品制备：在一张清洁无痕的载玻片上滴一滴生理盐水，用牙签刮自己的口腔粘膜少许或用镊子撕洋葱内表皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀，盖上清洁的盖玻
8、片，用滤纸条吸取盖片周围多余的水分，用指甲油封片（或不封片）。2.将10x相差物镜旋入光路。3.将相应于10x相差物镜的相差聚光器的环状光阑移入光路中，完全打开聚光器的孔径光阑。4.将样品置于载物台上，用聚焦螺旋聚焦样品。5.用柯勒照明法调节聚光器：将视场光阑关到最小；用聚光器升降调节螺旋，调节聚光器的上下位置，直至在目镜中观察到视场光阑像的边缘清楚；调节聚光器的调中螺旋，使视场光阑的像移至视场中央（调中聚光器）；打开视场光阑，使其边缘与目镜中的视场同样大小。柯勒照明是调好相差像的关键之一。6.观察物镜后焦面，调节仪器使聚光器中环状光阑的像和相差物镜中相板的圆环互相吻合，这一步是调好相差最重要
9、的步骤。具体方法是：取下一个目镜，插入一个聚焦望远镜，转动望远镜的接目镜，直到在望远镜中观察到清晰的环状光阑（在聚光器中）和相板（在相差物镜中）的像。如果环状光阑的明亮光圈与圆形相板不吻合，可以通过调节聚光器上的调中螺旋使之吻合。调节吻合后，取出聚焦望远镜，插入目镜，就可在目镜中观察到一个清晰的口腔上皮细胞的相差像。7.如果换用高倍相差物镜观察，需要移入相应的高倍相差物镜的聚光器环状光阑，重复以上调节步骤。五、思考题1.绘制口腔粘膜上皮细胞、洋葱内表皮细胞图（35个细胞），并比较暗视野和相差显微镜下洋葱内表皮细胞的差别？2.明视野和相差显微镜成像原理有哪些区别？相差显微镜的特殊组件是什么？六、
10、注意事项1.调节电源使光源强度较大；2.一定要完全将两环合轴。III.荧光显微镜的原理及使用（见实验七:叶绿体和细胞核的荧光观察）实验二 电子显微镜的原理及使用I. 透射电子显微镜的使用一、实验目的1.了解常规超薄切片技术的基本过程及原理； 2.了解透射电子显微镜的操作技术。 二、实验原理透射电子显微镜是发展最早、应用最广泛的电子显微镜。在细胞生物学上，可用于观察和研究细胞内部的亚显微镜结构、蛋白质、核酸等生物大分子的形态结构及病毒的形态结构。透射电子显微镜以电子枪作为照明光源，从电子枪灯丝发射的电子束经聚光镜会聚照射到样品上。带有样品结构信息的透射电子（transmission electr
11、ons，TE）进入成像系统，被各级成像透镜聚焦、放大后，投射在观察荧光屏上，形成透射电子显微镜像。 超薄切片技术是透射电镜样品制备最基本最常用的技术。生物样品的超薄切片过程是将含水的生物材料经过一系列的化学处理，使其被包埋在坚硬的树脂材料中，并且必须使其超微结构保存良好。这样在坚硬树脂材料中的生物样品就可以用超薄切片机切成厚度为50nm左右的超薄切片，以满足透射电镜对观察样品的要求。超薄切片制样过程较为复杂，包括取材、固定、脱水、包埋、切片、染色等基本步骤。每一步骤对于制片的成败都很关键，实验操作者必须认真严格地按照要求操作每一步骤，才能得到较好的观察效果。 三、仪器、材料与试剂（一）仪器、用
12、具透射电子显微镜、超薄切片机、制刀机、玻璃条、恒温箱、控温烤箱、冰箱、光学显微镜、磁力搅拌器、手术剪刀、眼科镊子、铜网镊子、量杯、量筒、烧杯、培养皿、注射器、吸管、青霉素小瓶、玻璃缸、载玻片、酒精灯、铜网、滤纸、牙签、睫毛笔、样品盒、包埋模具、医用胶布。（二）材料鼠肝或其他生物组织。（三）试剂0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）、2.5戊二醛、1锇酸、50乙醇、60乙醇、70乙醇、80乙醇、90乙醇、无水乙醇、环氧丙烷、环氧树脂包埋剂一套（包括环氧树脂Epon812）、十二烷基琥珀酸酐（DDSA）、甲基内次甲基邻苯二甲酸酐（MNA）、2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚（DMP30）、醋酸铀
13、染液、柠檬酸铅染液。四、实验方法与步骤（一）试剂配置1. 0.2molL磷酸盐缓冲溶液（PBS）A液：磷酸氢二钠12H2O，71.64g，加双蒸水溶解至1000ml。B液：磷酸二氢钠2H2O，31.21g，加双蒸水溶解至1000ml。 根据不同要求，按不同配比，可得不同pH值的0.2molL的磷酸盐缓冲溶液，见下表： 表2-1 不同配比的磷酸盐缓冲溶液的pH值 pH（25）7.07.27.47.6A液（ml）B液（ml）30.519.536.014.040.59.543.56.52. 2.5戊二醛固定液25戊二醛10ml，0.2mol/L PBS 50 ml，加双蒸水至100ml即可。 3.
14、1锇酸固定液 （1）配置2锇酸贮存液：取1g 安瓿四氧化锇泡酸48h，冲洗48h，双蒸水漂洗30min。干后用玻璃刀刻划12道痕，置入棕色磨口瓶，加双蒸水50ml，用力摇动使安瓿破碎。静置48h四氧化锇溶解后备用。4避光保存。 （2）配置1锇酸使用液（现用现配）：取2四氧化锇贮存液10ml，加0.2mol/L PBS l0ml混合。 4.不同浓度的乙醇溶液用无水乙醇稀释成90、80、70、60、50的乙醇。 5.环氧丙烷（必须无水）。 6.环氧树脂Epon812包埋剂（Luft配方）Epon812，90ml；DDSA（十二烷基琥珀酸酐，软化剂），6 ml；MNA（甲基内次甲基邻苯二甲酸酐，硬化剂），5ml；DMP-302,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚，按2%加入。使用时根据不同硬度要求按一定比例增减DDSA和MNA。DDSA液增多，则软；MNA液增多则硬。三种液体逐次加入
