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1、实验一 LB 培养基的配制和大肠杆菌的培养第一部分 理论知识一生物工程所需的微生物学原理基因工程主要采用革兰氏阴性细菌作为宿主细胞表达系统。下面着重讲述大肠杆菌。1. 大肠杆菌的一般特性大肠杆菌（Escherichia coli,简写为E.coli）属于革兰氏阴性细菌，大肠杆菌不仅能液体培养，也 能在固体培养基上很好地生长。在细菌培养过程中，有两方面的因素影响它的纯度：1.其它细菌造成的细菌污染。因此，用于培养 的所有药品、器皿必须消毒，全部过程应在无菌条件下操作；2.遗传的异质性。遗传上的异质性发生在 培养过程中原有细菌株系遗传成分的变异，导致原有标记性状的改变。其原因可能是天然突变的结果；
2、 或是在由质粒携带标记性状的情况下，异质性可能来自细胞分裂过程中质粒的丢失或质粒的分离。据 目前所知，许多质粒以相当高的频率在寄主细胞分裂时发生分离，从而引起所带性状的变化。2. 抗生素抗性抗生素阻止细菌生长往往有抑菌和杀菌两种方式。抑菌就是指药物仅仅使细菌生长受阻而未直接引起细胞死亡；而杀菌是指药物引起细胞裂解或死 亡。一种抗生素抑菌或杀菌效果取决于细菌接触药物的条件。例如，大肠杆菌接触低水平的四环素将 会通过四环素与核糖体结合，影响细菌蛋白质的合成而最终抑制细胞生长。然而，结合着四环素的核 糖体是可恢复的，因为受抑制的细胞被稀释到无药物的培养基上，将会重新恢复正常细胞的生长。这 种抑制的可
3、恢复性表明四环素正以抑菌的方式发挥功能。当四环素浓度加大，阻止细菌声中的另一种 方式变得明显而不可逆，亦即在高浓度下，四环素以杀菌方式发挥功能。细菌有三种抗生素抗性的机制：（ 1）抗生素在细菌中作用的目标位置发生了变化。例如蛋白质合 成抑制剂链霉素的抗性通常是由于细菌合成了一种变化了的核糖体蛋白质，这种蛋白质不再与链霉素 相连，因此阻止了链霉素的抑制行为；（ 2）组织药物进入细胞。如对四环素的抗性是由于细菌合成了 阻止四环素进入细胞的膜蛋白，因而四环素的穿透性大为减低所致；（ 3）改变或钝化药物。比如，对 青霉素的抗性通常是由于0-丙酰胺酶的分泌，这种酶可切割和钝化抗生素。抑制细胞生长的最低抗
4、生素浓度称为最小抑制浓度（MIC）。对许多抑菌的抗生素如四环素而言， 当培养基中抗生素浓度接近MIC时，细菌菌落变得很小。3. 细菌细胞的生长在最佳生长条件下，细菌以每20min分裂一次的速度进行繁殖。然而，这种速度仅能维持很短的 一段时间。当细菌被接种到新鲜培养基上，它们通常经历下面4 个时期：滞留适应期、对数生长期、 最高生长期和衰亡期。在对数生长期中，细菌以最大速度进行生长和繁殖。大多数重组 DNA 实验都 是在细菌处于对数生长期进行的。第二部分 实验操作一.LB培养基的配制1LB 液体培养基：配制 1L： 胰化蛋白胨（ Proteose peptone）10g酵母提取物（ Yeast
5、extract powder）5gNacl10g上述量的药品溶于900ml水中，至完全溶解后，用5M或10M NaOH调PH值至7.0,定容至1L, 15 lbf/in2（1.034X 105Pa）高压下灭菌 20min。2. LB固体培养基500ml：500ml的LB液体培养基中加入7.5g琼脂粉，100ml的LB液体培养基中加入1.5g琼脂粉。15 lbf/in2（1.034X 105Pa）高压下灭菌 20min。3. 所需灭菌的器皿或试剂LB 液体培养基， LB 固体培养基，蒸馏水，牙签，空三角瓶，过滤器，离心管，枪头， 40%甘油，培养皿二.大肠杆菌单菌落的制作和细菌培养1. 倒平板在
6、无菌条件下，将溶化的LB固体培养基轻轻倒入培养皿（直径为9cm）中，每100ml培养基大 约可倒5个平板，即每个平板需要20ml培养基。培养基中可根据实际需要加入抗生素（大肠杆菌中含 有质粒）或不加（空菌株）。本实验中培养含有Prok2的大肠杆菌需要加入终浓度为50ug/ml的卡那霉素（Kan），则100ml的 固体或液体培养基中需要加入50ul浓度为100ug/ul的卡那霉素。注意：加抗生素时，培养基不可太热，否则，抗生素失活，以握住不烫手为准。2. 划单菌落无菌条件下，待平板凝固后，用接种环蘸取少量菌液，在平板上划Z”形线，注意不要重叠或交 叉，然后盖好培养皿，用封口膜封好，37C过夜培养
7、15h左右。3. 细菌培养无菌条件下，用已灭菌的牙签挑取一单菌落，转入4-5ml含有（或不含）相应抗生素的LB液体培 养基中。37C过夜培养15h左右。实验二 细菌的保存和大肠杆菌质粒DNA的提取第一部分 理论知识一. 基因工程载体的特性基因工程中的载体应具有如下一些特性：I 能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在其DNA中插入外源基因后，仍然保持着稳 定的复制状态和遗传特性；II. 易于从宿主细胞中分离和纯化；III在其DNA序列中，具有适当的限制性内切酶位点（最好是单一酶切位点）。这些位点位于DNA复 制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制；
8、W.具有能够观察的表型特征，即有报告基因，在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA的 选择标志。基因工程载体主要有细菌质粒载体、噬菌体载体、柯氏质粒载体和病毒载体等，细菌质粒是基因 工程中最常用的载体，下面着重讲细菌质粒载体。二. 细菌质粒载体1. 质粒和质粒载体质粒广泛存在于细菌中，在某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在。细菌质粒（plasmid）是细菌染色体外的小型环状双链的DNA分子或DNA复制子，大小在1-200kb 之间。质粒分子本身含有复制功能的遗传结构，故能在细菌内独立地进行复制，并在细胞分裂时恒定 地遗传给子代细胞。质粒的复制不受宿主染色体的控制。一般说来，质粒不是细菌生长繁
9、殖所必需的 结构，就细胞生存而言，质粒是可有可无的。但质粒的存在会对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具 有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒DNA不但能在细菌中复制，并且在添加 真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核或真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中 表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。2. 质粒DNA的分子特性质粒 DNA 分子是裸露分子，大小在 1-200kb 之间，呈双链共价封闭环状、自然旋转成超螺旋构型 (closed circle DNA,ccDNA),有时会因单链断裂而成为开链环状DNA (open circle DNA, ocDNA)
10、,有 时双链断裂成线型DNA (liner DNA,1DNA)。由于它们的空间构型不同，这三种DNA分子的电泳行为 也不同。根据这一特性，常用琼脂糖凝胶电泳将它们分开。由于质粒DNA分子构型不同，它们与溴化 乙锭的结合能力也有差异，造成分子密度不同，因此它们在凝胶中的迁移速率也不同。 质粒的种类细菌的天然质粒种类很多，特征也不同。不同质粒在细菌内的复制方式也不同。按质粒复制与宿主 菌的相关程度，可以把质粒分为严密型质粒和松弛型质粒两类。严密型质粒的复制需要蛋白质和DNA聚合酶III的存在，它的复制与细菌的繁殖密切相关，当宿主 菌蛋白质合成停止时，质粒的DNA复制也就随之停止，每个细胞内只有1-
11、5个质粒，这类复制子在基 因克隆中应用前景不大。松弛型质粒的复制需要聚合酶I,在宿主菌内通常可含10-200个拷贝，而且不受宿主菌蛋白合成 的影响，当宿主菌蛋白质合成及染色体复制停止的情况下，可继续大量扩增至上千份。在质粒扩增时， 加入氯霉素抑制大肠杆菌蛋白质合成，正是基于这个原理达到进一步扩增松弛型质粒的目的。因此， 通常选用松弛型质粒作为基因工程载体，以期在质粒插入外源基因后，可在子代细菌的重组质粒中获 得高产量的目的基因。 质粒的报告基因基因工程中利用载体上特地引入的一些具有特殊标志意义的基因，来证明载体已经进入宿主细胞， 并可将含有目的基因的宿主细胞从其它细胞中识别和挑选出来。这种具有
12、标志意义的基因称为报告基 因(reporter gene)，也称标记基因。报告基因通常是处于另一基因下游，并可反映转录到上游基因表 达水平的基因。基因工程多用质粒做载体，质粒的报告基因在DNA重组工作中具有重要意义。虽然质粒不是细菌 生长繁殖所必需的结构，但质粒携带有某些遗传信息，所以质粒的存在会赋予宿主细胞一些遗传特征。 例如，抗药性质粒(R因子)能使宿主细胞对某些抗生素或重金属产生抗性；F因子决定大肠杆菌的性 别，故又称性因子。通过质粒的报告基因的表达可使宿主细胞呈现一些可观察到的细胞生物学特征， 通过质粒赋予细胞的表型可识别和筛选重组体 DNA 的转化子细菌。基因工程操作中以质粒作载体时
13、， 质粒的报告基因中最有应用价值和最常用的报告基因是抗药性基因，如抗氨苄青霉素、抗四环素、抗 氯霉素、抗卡那霉素或抗新霉素等抗生素抗性基因。利用这些遗传标志，可以证明载体已经进入宿主 细胞，并将含有目的基因的宿主细胞从其它细胞中挑选出来。 质粒载体的条件理想的细菌质粒载体，除与其他类型载体具有相同的特点外，还应具备以下条件：I、分子相对较小，约3-10kb左右，且具有松弛型复制子，能产生多拷贝以便于提取和纯化。质 粒分子量越小越能抵抗机械剪切力的切割，可容纳外源性 DNA 就越长（质粒一般最多只能接受小于 15kb的外源DNA插入片段，插入片段过大，会导致重组子扩增速度的减慢，甚至使插入片段丢
14、失）。 分子量小的质粒往往属于松弛型质粒，在细胞中拷贝数多、扩增后回收率高。细菌菌体的天然质粒往 往不能满足作为基因工程的载体的全部要求，需要对其进行改造。例如，某些细菌质粒太大，使其拷 贝数相应减少，不利于提高基因克隆的产量和纯度，也不利于对重组质粒进行分析，需要去除一些非 复制必需区段和不含选择性标记区段，使它变小。II、缺失流动基因（mob）。这样，质粒就不会从一个细菌接触转移到另一个细菌。III、DNA结构和功能清楚。只有这样，才能正确而有效地插入外源基因，并且不影响质粒自身复 制。W、具有插入失活的筛选标记。即具有一个或几个报告基因，而且限制性内切酶的单切点恰好在此 基因中。由于插入
15、外源基因后，这个报告基因灭活，从而便于筛选重组体。、在复制子以外适当的位置，存在几个单一内切酶位点，便于外源DNA片段插入； 人工改造质粒载体时，必须结合实际需要考虑这些条件。 质粒载体的多克隆位点 载体多克隆位点，也称限制性酶切位点库或多接头，是基因工程载体中人工合成的密集排列的系 列多克隆位点，由常用的限制性内切酶所能识别的序列组成。这些酶切位点一般都是单一的，在质粒 其它部位不再有这些位点。多克隆位点的优点在于，可选用任一种或几种酶作酶切，所产生的 DNA 片段有合适的末端接头， 便于重组等克隆操作。其不利之处是不能利用选择标志的失活来筛选重组体，但这一缺点可用别的方 法来弥补。第二部分
16、 实验操作一. 实验材料大肠杆菌Prok2-JM109, 40%甘油，溶液I,溶液II,溶液III, 3M NaAc，70%乙醇，异丙醇，无 水乙醇等。溶液I，溶液II,溶液III二实验仪器和设备三实验内容（一）细菌的保存在无菌条件下，向已灭菌的1.5ml离心管中加入0.5ml 40%甘油和0.5ml细菌培养物（含质粒或不含质粒），颠倒混匀后，用封口膜封口，并注明质粒和菌株的名称。保存于-20C或-70C长期保存。 注意：40%甘油已灭菌。（二）大肠杆菌质粒DNA的小量提取1 划单菌落（37C过夜培养12-16h）,挑一单菌落于4-5ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，37C 摇床过夜培养 12-16h， 250rpm；2. 取1.5
