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1、文档供参考，可复制、编制，期待您的好评与关注！ 细胞培养基的基本要求 体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH等诸多方面的要求。营养成分：1. 氨基酸：所有细胞都需要12种必须氨基酸：缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱氨酸。2. # # R4 ; b b: M( L: W单糖：六碳糖是主要能源，也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。 体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。3. 维生素：生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B
2、12都是培养基常有的成分。 4. -无机离子与微量元素：细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。5. 2 J. p. B2 i$ G9 s6 p- a1 g! L( j促生长因子及激素：o各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。6. 渗透压 ：8 r. s%细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定
3、耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg, 可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320mOsm/kg左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260320mOsm/kg的范围都适宜。7. pH、气体：是细胞生存的必需条件之一，所需气体主要是氧和二氧化碳。氧参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。一些细胞在缺氧情况下，借糖酵解也可获取能量，但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时，一般置细胞于95空气加5二氧化碳的混合气体环境中培养。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持培养基的pH有直接关系。动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，pH值约在7.27.4，在细胞
4、生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳不断被释放，培养液变酸，pH值发生变化。由于NaHCO3容易分解为二氧化碳，很不稳定，致使缓冲系统难以精确地控制。故这一缓冲系统适合密闭培养。HEPES结合碳酸氢钠使用，可提供更有效的缓冲体系，主要是防止pH值迅速变动，但最大缺点是在开放培养或观察时难以维持正常的pH值。造成pH波动主要是代谢产生的CO2，在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，培养基pH很快下降。为解决这一问题，合成培养基中使用了NaHCO3-CO2缓冲系统，并采用开放培养，使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中CO2浓度（5），与培养基中的NaHC
5、O3处于平衡状态。8. 无毒、无污染：体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。细胞培养基培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培
6、养基。 3 n6 ( i, p( . z3 s4 j x1. 天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。6 M1 Ud7 + N/ W( h/ R2. 合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。天然细胞培养天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用
7、天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。: g0 E6 m+ a血清种类( Y* Q/ X* R1 U+ 目前用于组织培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极
8、为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生1030天的小牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。 / w0 E% p# i3 L$ |4 l! s0 D0 y血清的主要成分血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长
9、活性是达到生理平衡的。( O- C5 w2 2 7 z血清主要作用1. 提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。2. 提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。* y/ _1 |, Y- F3. 提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。 S$ h9 $ E4 d4 J4 _4. 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤
10、。 / E: k0 + W4 I# l1 M5. 对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。 + R3 B$ W# G4 ?4 血清培养基主要问题 ) |. s& M# p- v1 2 X _O1 N+ |1. 血清的成份可能有几百种之
11、多，目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识，这给研究工作带来许多困难。 P4 ?1 O! d/ W2. 血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制。3. 对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态，血清可能促进某些细胞的生长（成纤维细胞）同时抑制另一类细胞生长（表皮细胞）。4. 血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁
12、殖细胞的多胺反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。5 _. x# i4 l, 1 Y- V( w7 . Y: % 5. 动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。* Z* V8 l+ W) A6. 取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性。 7. 大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。血清的质量标准血清质量高低取决于两方面因素：一是取材对象，二是取材过程。用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内，
13、取材过程应严格按照操作规程执行，制备出的血清要经过严格的质量鉴定。WHO公布的用动物细胞体外培养生产生物制品规程中的要求：& q6 R/ l8 Q5 M2 i1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。) ; t) N1 j1 tu7 M+ 3 2. 有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。! * ls2 3 o8 - l; p, b% 6 h3. 证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。 . X7 i( o+ O/ z. x h8 U9 ! Q7 T4. 血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。5. 无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国
14、家要求无细菌噬菌体污染。$ P- Y; r+ A- g7 h6. 对细胞有良好的支持繁殖作用。我国在对牛血清的质量2000年版中国生物制品主要原辅料质控标准中提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量，细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素等。血清质量的鉴定7 S2 s2 S5 F1. 理化性质：如渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（应小于20g/L)、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指标，血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低血清质量越高。血红蛋白也是越低越好。2. 微生物检测
15、：包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测，支原体是一种很小的微生物，可通过孔径22u的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难于察觉，细胞也能生长繁殖，但会影响实验结果。检测支原体的方法很多，如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观察法等。3. 促生长效果：这是血清重要的特性之一，应当以培养的细胞来检测。有以下方法：克隆形成率、贴瓶率测定法和连续传代培养法。（1） 克隆形成率测定:一般以悬浮生长的细胞为培养对象，按有限稀释法做克隆化培养，将不同批号的血清配制成不同浓度的培养基，细胞也稀释成不同浓度，接种到96孔板，每孔200ul，培养一定时间，统计有克隆生长的孔，计算出百分比，
16、再与对照的标准血清相比较，就可看出不同批号血清间的区别。比较低的浓度，更能观察出血清质量间的细微差别。# 1 J7 q$ p. j（2） 贴瓶率测定:是以贴壁细胞为培养对象，将细胞稀释至低密度，接种至平皿，每皿200或100个细胞，以不同浓度的血清培养基培养，培养一定时间后弃培养基，染色后统计集落数，计算出集落数占接种细胞数的百分比，同样再与标准血清比较，判断血清质量高低。（3） 连续传代培养法:是将细胞培养于3个一定体积的培养瓶中，待测血清配制为5浓度，一般于第七天收集细胞，计数，取平均值，中间可以更换一次培养基。连续测试三个周期以上，观察细胞生长状况，并将每次的计数结果与标准血清的测试结果比较。4. 对于使用者，判断血清质量先从外观入手。好的
