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1、液相色谱检测1 仪器的基本常识及术语1.1 仪器结构： 液相色谱仪主要包括泵、进样器、色谱柱、检测器；1.2 仪器分类： 液相色谱仪属于精密仪器中的色谱仪器； 按照分为离机制，吸附、分配、离子交换、亲和色谱，体积排阻色谱； 按照流动相与固定相的极性，分为正相色谱法和反相色谱法；1.2.2 高效液相色谱法的应用围 ：高效液相色谱法适用于高沸点不易 挥发、受热不稳定易分解、分子量大的，不同极性的有机化合物，生 物活性物质和多种天然产物，合成的和天然的高分子化合物等。1.3 仪器检定： 液相色谱仪检定周期为 1 年，在两次检定间期进行一次 期间核查，也可以根据情况增加核查次数；1.4 维护保养： 对
2、于液相维护方式主要是周维护和日维护，其中周维 护包括联机系统及中工作站软件维护、 数据库整理备份、 检测器自检、 维护单向阀、溶剂砂芯滤头、进样器、电机泵检查维护、溶剂瓶清洗 等；日维护包括环境温度、环境湿度、色谱柱温度、压力流速、进样 口是否洁净、进液处的砂芯过滤头是否洁净、流动相交换时是否有沉 淀；1.5 色谱法的常用基本术语基线：在色谱操作条件下 ,没有被测组分通过鉴定器时 ,记录器所记录的 检测器噪声随时间变化图线称为基线 .死时间 ,保留时间及校正保留时间 :从进样到惰性气体峰出现极大值的时间称为死时间，以td表示.从进样到出现色谱峰最高值所需的时间称 保留时间，以tr表示.保留时间
3、与死时间之差称校正保留时间以Vd表示.死体积 ,保留体积与校正保留体积 :死时间与载气平均流速的乘积称为 死体积，以Vd表示，载气平均流速以Fc表示,Vd=tdxFc.保留时间与载气 平均流速的乘积称保留体积，以Vr表示,Vr=trxFc峰面积：流出曲线(色谱峰)与基线构成之面积称峰面积，用A表示. 拖尾因子：是反映峰对称性的指标，计算公式：拖尾因子T =W0.05h/2d1 (其中W0.05h为5%峰高处的峰宽，di为峰顶点至峰前 沿之间的距离) 。峰高与半峰宽 :由色谱峰的浓度极大点向时间座标引垂线与基线相交 点间的高度称为峰高 ,一般以 h 表示.色谱峰高一半处的宽为半峰宽,一般以 x1
4、/2 表示；1.7 色谱检测的特性( 1 )灵敏度高；( 2)线性围宽；(3) 分离度与柱效、选择因子、容量因子、分析时间的关系：(4) 分离度与柱效的平方根成正比，选择因子一定时，增加柱效；( 5)分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常 数，随分离柱温度、柱压的改变而变化：一般通过改变固定相和流动 相的性质和组成或降低柱温，可增大选择因子；( 6)增大选择因子的最有效方法是选择合适的固定液。对于液相色谱，改变流动相的组成，可以有效控制 k；2 仪器的操作规程2.1 日立液相设备 L-2000/2400 操作规 程2.1.1 使用环境环境温度：4 C 55 C； 相对湿度：小于
5、 95%RH 。2.1.2 使用前准备检查所用溶液 (如流动相，乙腈等 ) 是否足够。 检查线路是否连接正常。2.1.3 设备操作方法具体操作如下：(1) 依次开启泵开关，检测器开关，自动进样器开关， 柱温箱开关；(2) 打开软件，点击“ i”按钮，出现联机界面，点击“ Iinitialize ” ini ?.laiz 按钮，当文本框出现文字时，表示联机成功；(3) 检查所用方法是否符合要求。如不符合，进行设置；(4) 开泵。检测具体操作如下：(1) 建立所需样品盒；(2) 点击检测按钮，选择刚建立的样品盒；(3) 首先进行走基线；(4) 当基线走平时，点击系列样品检测按钮，进行标样，样品检测
6、；(5) 当标样检测结果出来时，打开结果窗口，选择所需标样结果，点击“ Recalculateri:k ? lkjuleit 进行重新计算，然后点击“ Calibration ” k ? librei ?n 进行定标；(6) 当样品结果出来时，打开结果窗口，选择所需样品 结果，点击“ Recalculate ” ri:k ? lkjuleit 进行重新计算，然后点 击“ ModifyReport ” m ?difai, rip ?:t, ,出现结果报告，即可查看样品具体结果。2.1.4 更换流动相具体操作如下：(1) 当流动相快不够时或异常时，及时更换流动相；(2) 先把泵关闭，将流动相入口放
7、入新流动相中；(3) 将泵阀逆时针旋转，进行排气。大约 3分钟后，关闭 排气功能；(4) 排气完毕后，将泵阀顺时针旋转拧紧，开泵；(5) 走基线，当基线走平时，开始做标样，做样。2.1.5 关机具体操作如下：(1) 先把泵关闭，将流动相入口更换为超纯水；(2) 将泵阀逆时针旋转，进行排气。大约 3分钟后，关闭排气功能；(3) 排气完毕后，将泵阀顺时针旋转拧紧，开泵；(4) 用超纯水冲洗管路大约 20 分钟；(5) 把泵关闭，将超纯水更换为 100% 甲醇或100% 乙腈；(6) 将泵阀逆时针旋转，进行排气。大约3分钟后，关闭排气功能；(7) 排气完毕后，将泵阀顺时针旋转拧紧，开泵；(8) 用1
8、00% 甲醇或 100% 乙腈冲洗管路大约 30 分钟；(9) 关泵，关液相软件，关泵开关，检测器开关，自动 进样器开关，柱温箱开关。2.1.6 维护保养、注意事项(1) 进行旬维护检查工作，主要检查事项：软件是否正常、温度、 清洗、进样器、泵单元；(2) 每次测量前进行标样检测，斜率达到99.99% 要求才能检测样品，测完样品及时清理。(3) 按要求进行每天 2个小时以上的清洗。2.2 Waters 高效液相色谱 -2695/24892.2.1 开机自检具体操作如下：(1) 打开 Alliance ?lai ?ns 2695 和2489 的电源开关至 ON (1) 的位置，仪器开始进行自检；
9、(2) 仪器将进行大约 5分钟的自检过程，待仪器自我测试完毕后， 出现以下画面，画面上方的状态显示区会出现“ Idle ” aidl 状态， 表示开机测试正常。2.2.2 流动相有机溶剂要求用色谱纯 ( 进口名牌最好 )，水或缓冲盐溶液要用超 纯水(电阻率：18.2M Q)，每48小时制备新鲜的水相流动相，尤其是100% 含水流动相使用时间不超过两天。6根管子都在液面以下。溶剂的 位置必须高于溶剂混合 阀 (Gradient Proportioning Valve) 。 greidi ?nt pr?p?:?ni? v? lv清洗柱塞密封垫(Seal Wash) si：i w?习的溶液：含5%1
10、0%甲醇 的超纯水。洗针液(Needle Wash) ni：d ?l w ?: 50% 甲醇：50% 水(该比例仅 适用于反相试验 )。注：以上溶剂或溶液均需用0.45 pm的膜过滤并超声脱气1分钟，用洁净的玻璃容器盛放 ,避免污染， 同时玻璃容器应用超纯水来清洗而 不能用自来水。2.2.3 灌注柱塞密封清洗清洗操作步骤：(1) 回到 Menu menju： 画面，选择 Diag ；(2) 确定Seal Wash si：i w ?的管路放在正确的位置；(3) 按 Prime Seal Wash praim si:l w ?|，再按 Start，直到清洗溶 剂流出泵杆密封圈冲洗废液管，按 Hal
11、t ； h?：lt(4) 按 Close。注意：密封圈清洗 (Seal wash) si：l w ?溶剂，在反相液相色谱中 可 使 用 Water/ MeOH methyl alcohol 甲 醇 =90/10 或Water/Acetonitrile ? sit?unaitril 乙腈 =95/5( 根据实际需要使用不同 溶剂 )。2.2.4 灌注针头清洗操作步骤：回到 Main mein 的画面，选择 Diag ，选择 Prime praimNdl Wash。设定值为30秒，若想要多清洗几次时，请按Start Again 。清洗溶剂： 50% 的甲醇溶液 注意：若上述清洗溶剂无法避免进样时的
12、交叉污染，使用较强的 溶剂系统来进行清洗操作。2.2.5 打开真空脱气机 如液相仪管路干，可进行使用，如管路不干则按照以下步骤进行操作：按“ Menu/Status ” steit ?s键，进入Status 画面；利用方 向键将光标移至“ Degasser ” di：g? s?位置，按Enter ;利用上下键选 择模式为 ON 。注意：在开启除气装置时，要确认所有溶剂管路都充满溶剂；若 没有溶剂时请执行溶剂的 Dry Prime drai praim 操作。2.2.6 执行干灌注 确定流动相溶剂的管子放在正确的位置，检测器(Detectorditekt ?)废液管及定量环 (Sample Lo
13、op lu：p )的废液管是否放置于适 当的废液容器中。摇动溶剂瓶的过滤器 (Solvent Filter) s?lv?nt filt ?，防止气泡附 着在过滤器的外表面。将空的针筒插入抽液阀 (Prime/Vent value) 中，以逆时针的方向 旋转 3圈。按“ Menu/Status” steit ?s键，进入 Status(1)画面，按“ DirectFunction ” direktf ?k?n功能键，选择 Dry Prime，按 Enter。按下面使用的溶剂开启阀门(例如:Open A)，然后将针筒向外拉， 抽出510mL溶剂并完全抽出溶剂管子的气泡，完成后关闭 Prime/Ve
14、nt 阀门。在“ Enter a duration ” djurei ?n中输入 3分钟，按“ Continue ” 键，泵即以 3.0mL/min 的流速进行清洗 (Purge) 。可重复上两个步骤，将所要使用的流动相溶剂 Dry Prime 。2.2.7 执行湿灌注按“ Menu/Status ”键，进入 Status(1) 画面，利用方向键将光标 移至“ Composition ”k?mp?zi?n字段，将欲 Wet Prime 的溶剂输入100% 。按 “Direct Function” direktf ?k?n功能键，选择Wet Prime :按 Enter。Wet Prime 的原
15、设定值，一般为 Flow Rate:7.5mL/min ， Time: 3.0min ，然后按下“ OK ”键，泵即开始进行 Wet Prime 操作。重复上述的步骤直到所有溶剂 Wet Prime 进行完毕。2.2.8 设定流动相平衡色谱柱按“ Menu/Status ” 键，进入 Status (1) 画面，利用方向键将光 标移至“ Composition ” k ?mp?zi ?n字段，利用仪器面板右侧的数字 键设置试验要求的溶剂组成比例，此时会在原溶剂比例表的下方出现 新编辑溶剂比例表 (New Composition) 。设定好新的溶剂组成比例后，按“ Change Comp ” t?eind ? k?mp功能键 (改变溶剂组成比例 change composition) ，此设定的溶剂组成 比例即为当前的比例。利用方向键将光标移至“ Flow ” fl ?u字段，利用仪器面板右侧的 数字键设定流速，
