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1、液相色谱检测1 仪器的基本常识及术语1.1 仪器结构: 液相色谱仪主要包括泵、进样器、色谱柱、检测器;1.2 仪器分类: 液相色谱仪属于精密仪器中的色谱仪器; 按照分为离机制,吸附、分配、离子交换、亲和色谱,体积排阻色谱; 按照流动相与固定相的极性,分为正相色谱法和反相色谱法;1.2.2 高效液相色谱法的应用围 :高效液相色谱法适用于高沸点不易 挥发、受热不稳定易分解、分子量大的,不同极性的有机化合物,生 物活性物质和多种天然产物,合成的和天然的高分子化合物等。1.3 仪器检定: 液相色谱仪检定周期为 1 年,在两次检定间期进行一次 期间核查,也可以根据情况增加核查次数;1.4 维护保养: 对
2、于液相维护方式主要是周维护和日维护,其中周维 护包括联机系统及中工作站软件维护、 数据库整理备份、 检测器自检、 维护单向阀、溶剂砂芯滤头、进样器、电机泵检查维护、溶剂瓶清洗 等;日维护包括环境温度、环境湿度、色谱柱温度、压力流速、进样 口是否洁净、进液处的砂芯过滤头是否洁净、流动相交换时是否有沉 淀;1.5 色谱法的常用基本术语基线:在色谱操作条件下 ,没有被测组分通过鉴定器时 ,记录器所记录的 检测器噪声随时间变化图线称为基线 .死时间 ,保留时间及校正保留时间 :从进样到惰性气体峰出现极大值的时间称为死时间,以td表示.从进样到出现色谱峰最高值所需的时间称 保留时间,以tr表示.保留时间
3、与死时间之差称校正保留时间以Vd表示.死体积 ,保留体积与校正保留体积 :死时间与载气平均流速的乘积称为 死体积,以Vd表示,载气平均流速以Fc表示,Vd=tdxFc.保留时间与载气 平均流速的乘积称保留体积,以Vr表示,Vr=trxFc峰面积:流出曲线(色谱峰)与基线构成之面积称峰面积,用A表示. 拖尾因子:是反映峰对称性的指标,计算公式:拖尾因子T =W0.05h/2d1 (其中W0.05h为5%峰高处的峰宽,di为峰顶点至峰前 沿之间的距离) 。峰高与半峰宽 :由色谱峰的浓度极大点向时间座标引垂线与基线相交 点间的高度称为峰高 ,一般以 h 表示.色谱峰高一半处的宽为半峰宽,一般以 x1
4、/2 表示;1.7 色谱检测的特性( 1 )灵敏度高;( 2)线性围宽;(3) 分离度与柱效、选择因子、容量因子、分析时间的关系:(4) 分离度与柱效的平方根成正比,选择因子一定时,增加柱效;( 5)分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常 数,随分离柱温度、柱压的改变而变化:一般通过改变固定相和流动 相的性质和组成或降低柱温,可增大选择因子;( 6)增大选择因子的最有效方法是选择合适的固定液。对于液相色谱,改变流动相的组成,可以有效控制 k;2 仪器的操作规程2.1 日立液相设备 L-2000/2400 操作规 程2.1.1 使用环境环境温度:4 C 55 C; 相对湿度:小于
5、 95%RH 。2.1.2 使用前准备检查所用溶液 (如流动相,乙腈等 ) 是否足够。 检查线路是否连接正常。2.1.3 设备操作方法具体操作如下:(1) 依次开启泵开关,检测器开关,自动进样器开关, 柱温箱开关;(2) 打开软件,点击“ i”按钮,出现联机界面,点击“ Iinitialize ” ini ?.laiz 按钮,当文本框出现文字时,表示联机成功;(3) 检查所用方法是否符合要求。如不符合,进行设置;(4) 开泵。检测具体操作如下:(1) 建立所需样品盒;(2) 点击检测按钮,选择刚建立的样品盒;(3) 首先进行走基线;(4) 当基线走平时,点击系列样品检测按钮,进行标样,样品检测
6、;(5) 当标样检测结果出来时,打开结果窗口,选择所需标样结果,点击“ Recalculateri:k ? lkjuleit 进行重新计算,然后点击“ Calibration ” k ? librei ?n 进行定标;(6) 当样品结果出来时,打开结果窗口,选择所需样品 结果,点击“ Recalculate ” ri:k ? lkjuleit 进行重新计算,然后点 击“ ModifyReport ” m ?difai, rip ?:t, ,出现结果报告,即可查看样品具体结果。2.1.4 更换流动相具体操作如下:(1) 当流动相快不够时或异常时,及时更换流动相;(2) 先把泵关闭,将流动相入口放
7、入新流动相中;(3) 将泵阀逆时针旋转,进行排气。大约 3分钟后,关闭 排气功能;(4) 排气完毕后,将泵阀顺时针旋转拧紧,开泵;(5) 走基线,当基线走平时,开始做标样,做样。2.1.5 关机具体操作如下:(1) 先把泵关闭,将流动相入口更换为超纯水;(2) 将泵阀逆时针旋转,进行排气。大约 3分钟后,关闭排气功能;(3) 排气完毕后,将泵阀顺时针旋转拧紧,开泵;(4) 用超纯水冲洗管路大约 20 分钟;(5) 把泵关闭,将超纯水更换为 100% 甲醇或100% 乙腈;(6) 将泵阀逆时针旋转,进行排气。大约3分钟后,关闭排气功能;(7) 排气完毕后,将泵阀顺时针旋转拧紧,开泵;(8) 用1
8、00% 甲醇或 100% 乙腈冲洗管路大约 30 分钟;(9) 关泵,关液相软件,关泵开关,检测器开关,自动 进样器开关,柱温箱开关。2.1.6 维护保养、注意事项(1) 进行旬维护检查工作,主要检查事项:软件是否正常、温度、 清洗、进样器、泵单元;(2) 每次测量前进行标样检测,斜率达到99.99% 要求才能检测样品,测完样品及时清理。(3) 按要求进行每天 2个小时以上的清洗。2.2 Waters 高效液相色谱 -2695/24892.2.1 开机自检具体操作如下:(1) 打开 Alliance ?lai ?ns 2695 和2489 的电源开关至 ON (1) 的位置,仪器开始进行自检;
9、(2) 仪器将进行大约 5分钟的自检过程,待仪器自我测试完毕后, 出现以下画面,画面上方的状态显示区会出现“ Idle ” aidl 状态, 表示开机测试正常。2.2.2 流动相有机溶剂要求用色谱纯 ( 进口名牌最好 ),水或缓冲盐溶液要用超 纯水(电阻率:18.2M Q),每48小时制备新鲜的水相流动相,尤其是100% 含水流动相使用时间不超过两天。6根管子都在液面以下。溶剂的 位置必须高于溶剂混合 阀 (Gradient Proportioning Valve) 。 greidi ?nt pr?p?:?ni? v? lv清洗柱塞密封垫(Seal Wash) si:i w?习的溶液:含5%1
10、0%甲醇 的超纯水。洗针液(Needle Wash) ni:d ?l w ?: 50% 甲醇:50% 水(该比例仅 适用于反相试验 )。注:以上溶剂或溶液均需用0.45 pm的膜过滤并超声脱气1分钟,用洁净的玻璃容器盛放 ,避免污染, 同时玻璃容器应用超纯水来清洗而 不能用自来水。2.2.3 灌注柱塞密封清洗清洗操作步骤:(1) 回到 Menu menju: 画面,选择 Diag ;(2) 确定Seal Wash si:i w ?的管路放在正确的位置;(3) 按 Prime Seal Wash praim si:l w ?|,再按 Start,直到清洗溶 剂流出泵杆密封圈冲洗废液管,按 Hal
11、t ; h?:lt(4) 按 Close。注意:密封圈清洗 (Seal wash) si:l w ?溶剂,在反相液相色谱中 可 使 用 Water/ MeOH methyl alcohol 甲 醇 =90/10 或Water/Acetonitrile ? sit?unaitril 乙腈 =95/5( 根据实际需要使用不同 溶剂 )。2.2.4 灌注针头清洗操作步骤:回到 Main mein 的画面,选择 Diag ,选择 Prime praimNdl Wash。设定值为30秒,若想要多清洗几次时,请按Start Again 。清洗溶剂: 50% 的甲醇溶液 注意:若上述清洗溶剂无法避免进样时的
12、交叉污染,使用较强的 溶剂系统来进行清洗操作。2.2.5 打开真空脱气机 如液相仪管路干,可进行使用,如管路不干则按照以下步骤进行操作:按“ Menu/Status ” steit ?s键,进入Status 画面;利用方 向键将光标移至“ Degasser ” di:g? s?位置,按Enter ;利用上下键选 择模式为 ON 。注意:在开启除气装置时,要确认所有溶剂管路都充满溶剂;若 没有溶剂时请执行溶剂的 Dry Prime drai praim 操作。2.2.6 执行干灌注 确定流动相溶剂的管子放在正确的位置,检测器(Detectorditekt ?)废液管及定量环 (Sample Lo
13、op lu:p )的废液管是否放置于适 当的废液容器中。摇动溶剂瓶的过滤器 (Solvent Filter) s?lv?nt filt ?,防止气泡附 着在过滤器的外表面。将空的针筒插入抽液阀 (Prime/Vent value) 中,以逆时针的方向 旋转 3圈。按“ Menu/Status” steit ?s键,进入 Status(1)画面,按“ DirectFunction ” direktf ?k?n功能键,选择 Dry Prime,按 Enter。按下面使用的溶剂开启阀门(例如:Open A),然后将针筒向外拉, 抽出510mL溶剂并完全抽出溶剂管子的气泡,完成后关闭 Prime/Ve
14、nt 阀门。在“ Enter a duration ” djurei ?n中输入 3分钟,按“ Continue ” 键,泵即以 3.0mL/min 的流速进行清洗 (Purge) 。可重复上两个步骤,将所要使用的流动相溶剂 Dry Prime 。2.2.7 执行湿灌注按“ Menu/Status ”键,进入 Status(1) 画面,利用方向键将光标 移至“ Composition ”k?mp?zi?n字段,将欲 Wet Prime 的溶剂输入100% 。按 “Direct Function” direktf ?k?n功能键,选择Wet Prime :按 Enter。Wet Prime 的原
15、设定值,一般为 Flow Rate:7.5mL/min , Time: 3.0min ,然后按下“ OK ”键,泵即开始进行 Wet Prime 操作。重复上述的步骤直到所有溶剂 Wet Prime 进行完毕。2.2.8 设定流动相平衡色谱柱按“ Menu/Status ” 键,进入 Status (1) 画面,利用方向键将光 标移至“ Composition ” k ?mp?zi ?n字段,利用仪器面板右侧的数字 键设置试验要求的溶剂组成比例,此时会在原溶剂比例表的下方出现 新编辑溶剂比例表 (New Composition) 。设定好新的溶剂组成比例后,按“ Change Comp ” t?eind ? k?mp功能键 (改变溶剂组成比例 change composition) ,此设定的溶剂组成 比例即为当前的比例。利用方向键将光标移至“ Flow ” fl ?u字段,利用仪器面板右侧的 数字键设定流速,