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1、 技术咨询电话：400-607-9999胞核胞浆胞膜制制备试剂盒 Nucl-Cyyto-Meem Preeparattion KKit货号：P0600004描述：从哺乳动动物新鲜或冻冻存的组织块块、贴壁或悬悬浮培养细胞胞中，制备细细胞核、细胞胞膜与胞内质质膜、细胞浆浆等三种主要要亚细胞组分分。独特的试试剂成分与优优化的制备方方案相结合，使使胞核-胞膜-胞浆制备过过程简单易行行，无需特殊殊设备和超速速离心，制备备过程可在11小时内完成成。制备的细细胞核、细胞胞浆组分纯度度甚高，而且且较少交叉污污染。单一的的细胞膜的纯纯化是一个特特殊问题，本本试剂盒制备备的胞膜是细细胞膜和细胞胞器如线粒体体、内质
2、网、高高尔基体及其其质膜的混合合物。制备的的细胞核是完完整的未裂解解的细胞核，但但胞浆组分为为可溶性胞浆浆蛋白。制备备的亚细胞组组分的纯度可可胜任后续免免疫共沉淀、SDS-PAGE、2-D gel电泳、Western Blotting、酶活性测定、受体分析等。组成：(50 extraactionns, 8 x 1066 cellls perr extrractioon)CER, Cyytosoll Extrractioon Reaagent，25ml; MER, Meembranne Exttractiion Reeagentt，2.5 mllNER, Nucleear Exxtracttio
3、n RReagennt，50 ml;Suspenssion BBufferr，10 ml 储存：4 CC避光保存1年。收集细胞：准确确计数，每一一制备使用等等量的细胞数数，将明显改改善后续检测测结果的一致致性。每一制制备约需要88 x 1006 1 x 1077个细胞。贴壁细胞：PBBS冲洗细胞胞皿，胰蛋白白酶消化细胞胞。800 x g 离离心5-100 min。弃弃上清，用PPBS重悬洗洗涤细胞并再再次离心收集集细胞。注意意：为避免胰胰蛋白酶在后后续制备过程程中降解蛋白白质，可用无无酶细胞消化化液(Non-eenzymee Celll Disaassociiation Soluttion)使
4、贴壁培养养的细胞与瓶瓶皿分离。悬浮细胞：8000 x gg 离心5-100 min。弃弃上清。用PPBS重悬洗洗涤细胞并再再次离心收集集细胞。估计细胞沉淀压压积PCV (packked ceell voolume)：通常1 x 106 个细胞离心心后的PCVV约为10-20 ml，1 x 1107 个细胞的PCCV约为100 ml。注意PCVV大小与细胞胞数量有关，也也与细胞类型型、大小、离离心速度有关关。制备步骤 制备全程在4 C或冰水水浴中进行。1.1 细胞匀匀浆裂解每1 x 1007个细胞或100 ml PCV的细胞胞沉淀加入5500 ml CER试剂剂，震荡重悬悬。冰浴2 min。将将
5、细胞悬液转转移到冰预冷冷的玻璃匀浆浆器内。冰上上上下手动匀匀浆20-330次。注意：破破碎细胞是关关键环节。用用1-3 mml小容积玻玻璃匀浆器，须须选用间隙严严密的研杵，其其特征是将研研杵插入匀浆浆器套管后，可可提起研杵而而套管不会脱脱落。有效研研磨是上下推推拉研磨而不不是旋转。破破碎效果与细细胞类型有关关。可在相差差显微镜下检检查，未裂解解细胞应少于于5%。1.2 组织块块匀浆裂解取250 mgg哺乳动物新新鲜或-800 C冻存存的组织块，勿勿剪碎为更小小的块。放入入冰预冷的玻玻璃匀浆器内内。加入500 ml CER试剂剂。用研杵旋旋转将组织块块捣碎，上下下手动预匀浆浆20次。冰浴浴10
6、miin。然后上上下手动预匀匀浆7次。注意：与培养细细胞特别是贴贴壁细胞相比比，组织块中中的细胞在匀匀浆时较易破破碎，因而并并非必须选用用间隙严密的的研杵。如果果研杵与套管管过于严密，组组织匀浆困难难，可选用研研杵与套管稍稍松的匀浆器器。破碎效果果与组织细胞胞类型有关。可可在相差显微微镜下检查，未未裂解细胞应应少于5%。2. 取出5500 ml裂解混合物物，转移到11.5 mll离心管。800 g，4 C离心心5 minn。粗细胞核核沉淀在管底底，上清为胞胞膜-胞浆混合物物。按照以下下步骤首先制制备膜与胞浆浆，然后制备备细胞核，或或用两台离心心机同时制备备。3. 膜与胞浆浆制备：3.1. 将步
7、步骤2 获得的上上清液转移到到新管，估计计上清液体积积；3.2. 立即即加入1/110积量的MERR与上清液混混合。冰浴55分钟；3.3. 最大大转速14,000 rrpm 4 C离心30分钟；3.4. 取出出上清液转移移到新管，此此为胞浆组分分；3.5. 沉淀淀为胞膜组分分，含细胞膜膜和细胞内质质膜的混合物物。再次瞬时时离心除尽液液体，用1000 ml或适宜体积的的Suspeensionn Bufffer或自备备溶液重悬胞胞膜。4. 细胞核制制备：4.1. 加入入500 ml NERR，振荡重悬悬步骤2 获得的粗粗核。必要时时按步骤1.1匀浆胞核核；4.2. 40000 g，4 C离心心5
8、minn。弃上清；4.3. 再次次加入5000 ml NERR洗涤胞核沉淀淀，并重复步步骤4.2，离心心后的上清应应清亮；4.4. 弃上上清除尽液体体。用1000 ml或适宜体积Suuspenssion BBufferr或自备溶液液重悬细胞核核。说明1. 制备的胞浆组分分或重悬于SSuspennsion Buffee的胞膜胞核核组分可进行行Bradfford法、Lowrry法、BCA法蛋白白定量、酶活活性测定、受受体分析。但但进行免疫共共沉淀、SDDS-PAGGE、2-D ggel电泳、Wesstern Blot之之前，需要11:1加入自自备的2x 样品缓冲液液(含适宜浓度度的去垢剂如如NP-
9、400、Tritoon X-1100、SDS)。用用户可不用KKit中的Susppensioon Bufffer，而而直接用自行行配制的样品品缓冲液重悬悬胞核或胞浆浆沉淀，但这这是要考虑自自配缓冲液中中是否有影响响蛋白定量的的因素。2. 用SDS-PAAGE Looadingg 缓冲液裂裂解细胞核后后，DNA释放会会使核裂解物物十分粘稠，可可95 CC加热5 miin，高速振振荡打断DNNA，重复加加热2-3次。3. 如果为凝胶阻滞滞实验(EMMSA)目的的提取核蛋白白，建议用#P12000: 核-胞浆蛋白制制备试剂盒 (Nucllear-CCytosool Exttractiion Kiit)，该试试剂盒并非提提取完整的细细胞核，而是是直接提取可可溶性核蛋白白，可用于EEMSA或Westeern Bllot分析。4. 试剂盒不包含蛋蛋白酶抑制剂剂。通常4 C操作不不用蛋白酶抑抑制剂不会出出现问题。注意：本制品仅供研究使用，请勿用于临床治疗等其他用途
