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1、预防兽医学专业毕业论文 精品论文 分泌型IgA嵌合抗体基因的构建及在CHO细胞中的表达研究关键词：禽流感病毒 嵌合SIgA抗体 基因表达 抗H5N1病毒摘要：本研究选择在中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary, CHO)细胞中表达具有中和活性的抗H5N1病毒的嵌合SIgA抗体，尝试研发预防性分泌型IgA类抗体。 采用本实验室建立的“基因组DNA剪接(Genomic DNA Splicing，GDS)”技术，根据已发表的人IgJ、pIgR和IGHA的核苷酸序列，通过计算机软件分别设计各个基因片段外显子的优化引物，从人外周血基因组DNA中直接扩增各基因的外显子序列；然后人工设计融
2、合相邻外显子的融合引物，采用重叠PCR技术，把各基因片段的外显子串联起来形成全长编码序列，完成基因组DNA的体外剪接，扩增的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector中。序列分析表明，GDS技术扩增的IgJ、pIgR和IGHA基因与GenBank中的目标基因序列完全一致，其中IGHA为IgA2恒定区的序列。 从分泌抗禽流感H5N1-HA单抗的杂交瘤细胞HA9中提取总RNA，应用RT-PCR扩增VK和VH基因及信号肽序列，PCR产物克隆到pMD18-T载体上进行序列分析，经分析为小鼠免疫球蛋白基因，重链可变区共有414个碱基，前57个核苷酸编码19个氨基酸前导序列，其VH属于Ig
3、HVI家族，D段来自IgHVIV家族，J段来自IgHV II家族；轻链可变区共有393个碱基，前60个核苷酸编码20个氨基酸前导序列，V段为IgKVIII家族，J段为IgKJ I家族。 通过融合PCR将鼠源VH基因与人IGHA2基因拼接，VK基因与人CK连接，完成了人/鼠嵌合IgA抗体基因的构建。将人/鼠嵌合IgA抗体重、轻链基因分别克隆到以CMV早期启动子引导，以二氢叶酸还原酶基因(DHFR)和新霉素抗性基因(NEO)为双筛选标记pEF-dhfr-Neo载体中。将IgJ、pIgR基因克隆剑以CMV早期启动子引导，以新霉素抗性基因(NEO)为筛选标记pcDNA3.1(+)中。同时通过“质粒快速
4、定带点突变”技术将pcDNA3.1(+)-pIgR中多聚免疫球蛋白受体基因胞内区突变掉，从而完成人分泌成分(secretory component，SC)的真核表达载体构建。 用构建的pEF-IGHA9和pEF-IGK9表达质粒转染CHO/dhfr细胞，经选择培养基(无次黄嘌呤、胸腺嘧啶的DMEM)筛选，挑取阳性克隆用MTX加压进一步提高表达量。对此细胞株扩大培养并纯化抗H5N1病毒的嵌合IgA抗体，用专一性结合人源抗体Kappa链的蛋白L亲和层析柱从含有牛血清的CHO细胞培养上清中纯化重组人源抗H5N1-HA IgA抗体，并进行免疫学特性的分析。同时将构建的pEF-IGHA9、pEF-IGK
5、9、pcDNA3.1(+)-SC和pcDNA3.1(+)-IgJ表达质粒瞬时共转染CHO/dhfr细胞，培养48-72 h的细胞上清，使刚ELISA检测嵌合SIgA抗体各组分的分泌情况。 综上所述，本研究成功克隆了人IGHA2、IGJ和pIgR/SC基因以及抗H5N1病毒中和性单抗的V区基因，并对该V区基因序列进行胚系基因片段的分析；获得了完整人-鼠嵌合IgA抗体基因：构建了重组SlgA各相关基因的表达载体；通过转染CHO细胞，初步获得了嵌合IgA和SIgA抗体。正文内容 本研究选择在中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary, CHO)细胞中表达具有中和活性的抗H5N1病毒的嵌
6、合SIgA抗体，尝试研发预防性分泌型IgA类抗体。 采用本实验室建立的“基因组DNA剪接(Genomic DNA Splicing，GDS)”技术，根据已发表的人IgJ、pIgR和IGHA的核苷酸序列，通过计算机软件分别设计各个基因片段外显子的优化引物，从人外周血基因组DNA中直接扩增各基因的外显子序列；然后人工设计融合相邻外显子的融合引物，采用重叠PCR技术，把各基因片段的外显子串联起来形成全长编码序列，完成基因组DNA的体外剪接，扩增的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector中。序列分析表明，GDS技术扩增的IgJ、pIgR和IGHA基因与GenBank中的目标基因序列完
7、全一致，其中IGHA为IgA2恒定区的序列。 从分泌抗禽流感H5N1-HA单抗的杂交瘤细胞HA9中提取总RNA，应用RT-PCR扩增VK和VH基因及信号肽序列，PCR产物克隆到pMD18-T载体上进行序列分析，经分析为小鼠免疫球蛋白基因，重链可变区共有414个碱基，前57个核苷酸编码19个氨基酸前导序列，其VH属于IgHVI家族，D段来自IgHVIV家族，J段来自IgHV II家族；轻链可变区共有393个碱基，前60个核苷酸编码20个氨基酸前导序列，V段为IgKVIII家族，J段为IgKJ I家族。 通过融合PCR将鼠源VH基因与人IGHA2基因拼接，VK基因与人CK连接，完成了人/鼠嵌合Ig
8、A抗体基因的构建。将人/鼠嵌合IgA抗体重、轻链基因分别克隆到以CMV早期启动子引导，以二氢叶酸还原酶基因(DHFR)和新霉素抗性基因(NEO)为双筛选标记pEF-dhfr-Neo载体中。将IgJ、pIgR基因克隆剑以CMV早期启动子引导，以新霉素抗性基因(NEO)为筛选标记pcDNA3.1(+)中。同时通过“质粒快速定带点突变”技术将pcDNA3.1(+)-pIgR中多聚免疫球蛋白受体基因胞内区突变掉，从而完成人分泌成分(secretory component，SC)的真核表达载体构建。 用构建的pEF-IGHA9和pEF-IGK9表达质粒转染CHO/dhfr细胞，经选择培养基(无次黄嘌呤、
9、胸腺嘧啶的DMEM)筛选，挑取阳性克隆用MTX加压进一步提高表达量。对此细胞株扩大培养并纯化抗H5N1病毒的嵌合IgA抗体，用专一性结合人源抗体Kappa链的蛋白L亲和层析柱从含有牛血清的CHO细胞培养上清中纯化重组人源抗H5N1-HA IgA抗体，并进行免疫学特性的分析。同时将构建的pEF-IGHA9、pEF-IGK9、pcDNA3.1(+)-SC和pcDNA3.1(+)-IgJ表达质粒瞬时共转染CHO/dhfr细胞，培养48-72 h的细胞上清，使刚ELISA检测嵌合SIgA抗体各组分的分泌情况。 综上所述，本研究成功克隆了人IGHA2、IGJ和pIgR/SC基因以及抗H5N1病毒中和性单
10、抗的V区基因，并对该V区基因序列进行胚系基因片段的分析；获得了完整人-鼠嵌合IgA抗体基因：构建了重组SlgA各相关基因的表达载体；通过转染CHO细胞，初步获得了嵌合IgA和SIgA抗体。本研究选择在中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary, CHO)细胞中表达具有中和活性的抗H5N1病毒的嵌合SIgA抗体，尝试研发预防性分泌型IgA类抗体。 采用本实验室建立的“基因组DNA剪接(Genomic DNA Splicing，GDS)”技术，根据已发表的人IgJ、pIgR和IGHA的核苷酸序列，通过计算机软件分别设计各个基因片段外显子的优化引物，从人外周血基因组DNA中直接扩增各基
11、因的外显子序列；然后人工设计融合相邻外显子的融合引物，采用重叠PCR技术，把各基因片段的外显子串联起来形成全长编码序列，完成基因组DNA的体外剪接，扩增的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector中。序列分析表明，GDS技术扩增的IgJ、pIgR和IGHA基因与GenBank中的目标基因序列完全一致，其中IGHA为IgA2恒定区的序列。 从分泌抗禽流感H5N1-HA单抗的杂交瘤细胞HA9中提取总RNA，应用RT-PCR扩增VK和VH基因及信号肽序列，PCR产物克隆到pMD18-T载体上进行序列分析，经分析为小鼠免疫球蛋白基因，重链可变区共有414个碱基，前57个核苷酸编码19个
12、氨基酸前导序列，其VH属于IgHVI家族，D段来自IgHVIV家族，J段来自IgHV II家族；轻链可变区共有393个碱基，前60个核苷酸编码20个氨基酸前导序列，V段为IgKVIII家族，J段为IgKJ I家族。 通过融合PCR将鼠源VH基因与人IGHA2基因拼接，VK基因与人CK连接，完成了人/鼠嵌合IgA抗体基因的构建。将人/鼠嵌合IgA抗体重、轻链基因分别克隆到以CMV早期启动子引导，以二氢叶酸还原酶基因(DHFR)和新霉素抗性基因(NEO)为双筛选标记pEF-dhfr-Neo载体中。将IgJ、pIgR基因克隆剑以CMV早期启动子引导，以新霉素抗性基因(NEO)为筛选标记pcDNA3.
13、1(+)中。同时通过“质粒快速定带点突变”技术将pcDNA3.1(+)-pIgR中多聚免疫球蛋白受体基因胞内区突变掉，从而完成人分泌成分(secretory component，SC)的真核表达载体构建。 用构建的pEF-IGHA9和pEF-IGK9表达质粒转染CHO/dhfr细胞，经选择培养基(无次黄嘌呤、胸腺嘧啶的DMEM)筛选，挑取阳性克隆用MTX加压进一步提高表达量。对此细胞株扩大培养并纯化抗H5N1病毒的嵌合IgA抗体，用专一性结合人源抗体Kappa链的蛋白L亲和层析柱从含有牛血清的CHO细胞培养上清中纯化重组人源抗H5N1-HA IgA抗体，并进行免疫学特性的分析。同时将构建的pE
14、F-IGHA9、pEF-IGK9、pcDNA3.1(+)-SC和pcDNA3.1(+)-IgJ表达质粒瞬时共转染CHO/dhfr细胞，培养48-72 h的细胞上清，使刚ELISA检测嵌合SIgA抗体各组分的分泌情况。 综上所述，本研究成功克隆了人IGHA2、IGJ和pIgR/SC基因以及抗H5N1病毒中和性单抗的V区基因，并对该V区基因序列进行胚系基因片段的分析；获得了完整人-鼠嵌合IgA抗体基因：构建了重组SlgA各相关基因的表达载体；通过转染CHO细胞，初步获得了嵌合IgA和SIgA抗体。本研究选择在中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary, CHO)细胞中表达具有中和活性
15、的抗H5N1病毒的嵌合SIgA抗体，尝试研发预防性分泌型IgA类抗体。 采用本实验室建立的“基因组DNA剪接(Genomic DNA Splicing，GDS)”技术，根据已发表的人IgJ、pIgR和IGHA的核苷酸序列，通过计算机软件分别设计各个基因片段外显子的优化引物，从人外周血基因组DNA中直接扩增各基因的外显子序列；然后人工设计融合相邻外显子的融合引物，采用重叠PCR技术，把各基因片段的外显子串联起来形成全长编码序列，完成基因组DNA的体外剪接，扩增的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector中。序列分析表明，GDS技术扩增的IgJ、pIgR和IGHA基因与GenBan
16、k中的目标基因序列完全一致，其中IGHA为IgA2恒定区的序列。 从分泌抗禽流感H5N1-HA单抗的杂交瘤细胞HA9中提取总RNA，应用RT-PCR扩增VK和VH基因及信号肽序列，PCR产物克隆到pMD18-T载体上进行序列分析，经分析为小鼠免疫球蛋白基因，重链可变区共有414个碱基，前57个核苷酸编码19个氨基酸前导序列，其VH属于IgHVI家族，D段来自IgHVIV家族，J段来自IgHV II家族；轻链可变区共有393个碱基，前60个核苷酸编码20个氨基酸前导序列，V段为IgKVIII家族，J段为IgKJ I家族。 通过融合PCR将鼠源VH基因与人IGHA2基因拼接，VK基因与人CK连接，完成了人/鼠嵌合IgA抗体基因的构建。将人/鼠嵌合IgA抗体重、轻链基因分别克隆到以CMV早期启动子引导，以二氢叶酸还原酶基因(DHFR)和新霉素抗性基因(NEO)为双筛选标记pEF-dhfr-Neo载体中。将IgJ、pIgR基因克隆剑以CMV早期启动子引导，以新霉素抗性基
