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1、一细胞培养技术细胞周期的测定一、原理 细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等，这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如
2、果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。二、仪器、用品与试剂1、仪器、用品：同常规细胞培养2、试剂：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2SSC液三、操作步骤1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10g/ml。2、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1g。3、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。4、常规染色体制片（见第三部分：染色体技术）。5、染色体玻片置56水浴锅盖上，铺上2SSC 液，距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。6、弃去2SSC液，流水冲洗。7、
3、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。8、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。9、计算：细胞周期（Tc）=48/（M1+2M2+3M3+4M4）/100（小时）附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十双蒸水10ml 4下避光保存。 （2）2SSC配制: NaCl 1.75克，柠檬酸三钠2H2O 0.88克，加水至100ml，4保存。细胞的冻存和复苏 一、原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条
4、件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在130以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。二、操作步骤（一）冻存1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5106/ml左右。4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属
5、重物和一细绳。7、按下列顺序降温：室温4（20分钟）冰箱冷冻室（30分钟）低温冰箱（30 1小时）气态氮（30分钟）液氮。注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用11.5月。（二）复苏1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37的温水。2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37培养，第二天观察生长
6、情况。三、试剂和器材器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等试剂：0.25胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）附：冻存液配制：培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达520%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4下保存。细胞系或细胞株的建立 一、概念 1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。 2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培
7、养期间始终存在。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。二、建立细胞系（或株）的要求什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明：1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物； 个体性别、年龄；取材的器官或组织。 如系肿瘤组织，应说明临床和
8、病理诊断，以及病历号等。2、细胞生物学检测：了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。三、若干细胞建株的要点及基本过程（一）肿瘤细胞培养技术要点1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其
9、培养方法及冻存方法同前述正常组织。2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物
10、媒介培养。 （二）人类淋巴母细胞建株方法l、4ml肝素抗凝血于离心管中，加入2ml RPMI 1640。2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。3、1500rpm，15min，吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。4、加RPMI 1640 5ml洗涤白细胞两次。 5、将白细胞接种至1ml RPMI 1640培养基中，加入10l环胞霉素和100l的EBV（EB病毒）液，混匀。6、水浴摇床，40次/分，37，3hr。 7、1500rpm，15min。将细胞接种至1ml培养基中（内含谷氨酰胺1mMml）加入10l环胞霉素，轻轻混匀，37培养。8、5天后观察细胞转化和
11、生长情况，决定是否半量换液。一般半量换液l2次，并维持环胞霉素的浓度。9、待转化细胞数量明显上升，并出现细胞团块后，可转入25ml细胞培养瓶中，加12ml培养基，37培养1015天，一般每隔34天观察一次，决定是否换液，传代。10、细胞生长达一定数量后冻存，冻存前应进行核型分析和存档。个别组织细胞的培养体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施亦不尽相同，现介绍个别组织细胞培养的要点如下:一、上皮细胞培养上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养
12、特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。以表皮细胞为例，用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞，其法如下（黑木凳志夫1981）1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.51平方厘米小
13、块。2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。3、换入0.25%胰蛋白酶中，4过夜。4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37，3060分钟。6、反复吹打，制成悬液。7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。二、内皮细胞培养内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，其法如下：1、产后新鲜脐带，无菌剪取1015厘米长
14、一段，如不能立即培养，可于12小时内保存于4。2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化310分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。三、神经胶质细胞培养神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞
15、因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等诱发转化。养方法如下：1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。2、置于3050倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。3、把悬液注入离心管室温中直立510分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即
