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1、细胞培养程序材料A、仪器1. 净化工作台，2.离心机，3恒温水浴箱，4.冰箱（4C）5. 倒置相差显微镜， 6. CO2 培养箱， 7. 振荡混合仪8. 酶联免疫检测仪， 9. 移液枪， 10. 电磁力搅拌机， 11. 微孔滤器B、玻璃器皿1. 吸管，2.小烧杯（100ml）, 3.废液缸，C、塑料器皿1. 吸头， 2. 枪头， 3. 96 孔培养板， 4. 15ml 离心管，5. 50ml 离心管， 6. 胶塞，D、其他物品1. 微量加样枪， 2. 红血球计数板，F、试剂1. D-Hanks 液， 2. 小牛血清， 3. RPMI1640，4. 双抗（青霉素、链霉素）， 5. 0.25%胰酶
2、， 6.0.025% EDTA7. 二甲基亚砜（ DMSO），8. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电 磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4C保存备用，两 周内有效。一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养：（一）细胞原代培养1. 贴壁细胞培养法：1）、组织块培养法将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2此， 5 分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清， 用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37、 5%CO2条件下30分钟后将
3、培养瓶正置，从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小 牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml),使组织块有培养液与其接触 为准，轻轻放置于 37培养。待24 小时候补液。或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶 塞，将瓶倾斜放置在37C温箱内。培养24小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢 翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块 漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠 尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养 24 小时后 再补液，培养 35 天时可换液，一方面补充营养，
4、一方面去除代谢产物和漂浮小 块所产生的毒性作用。其他方法：消化分离法 、器官培养 略2. 悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌 细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层 液分离后接种培养。(二) 细胞株(系)细胞复苏培养 细胞复苏的主要操作步骤(1) 佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。(2) 迅速放入38C水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。(3) 然后在无菌下取出细胞。冻存管用 75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管 将细胞悬液注入离心管中，再滴加 10ml 培养液。(4) 在1000r/min
5、速度下离心510分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种 于培养瓶中，接种浓度1X109/L,置37C温箱静置培养，次日更换一次培养液， 继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞 加入瓶中，并加入培养基贴壁培养1224小时后，充去上清，换入新鲜培养基 继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为 106，则稀释 10 倍使细胞达到 105即可。注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管， 使之尽快通过最易受损的温度段(-50C)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生 长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有
6、时也会有部分细 胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上（已死亡）的细胞轻轻倒掉，再补以 适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。二、细胞维持培养（细胞换液培养）、培养选拔常规观察（ 一 ） 原代细胞的维持1、贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液） 一般三天后组织块周围即可见梭形细胞长出。第三天换液一次，其换液方法比较 简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。若希望细胞能在较 长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含 2%小牛血清的维持液。 待不 同组织块周围的细胞连接成片时即可传代。2、悬浮细胞 凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞，需在倒置显微镜下方可 观察到细胞的
7、形态和生长现象，淋巴细胞的短期培养无需换液，但加入生长因子 或有丝分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，细胞不仅会发生转化而且 会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，加之代 谢产物增多， pH 变酸，细胞不适宜生长，需进行换液。白血病细胞或淋巴瘤细 胞体外长期培养时，都需换液培养，待达到饱和密度时才能传代。换液时，只能 采用半量换液的方式，千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。 半量换液的方法如下：将原培养瓶竖起，在 30 分钟内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸去一半上清 弃去，再加入等量的新鲜完全培养基。若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，
8、采用低速离心（1000r/min lOmin）弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基， 混匀后再转入原瓶继续培养。（二）传代细胞维持培养：同上（三）培养选拔常规观察：1. 培养液2. 细胞生长情况3. 细胞形态变化4. 污染情况三、细胞的传代培养： （1）弃旧培养液：吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以 25mL 培养瓶为例）。（2）漂洗:每瓶加入2mL,无钙、镁PBS或HANKS液,漂洗贴壁细胞一次后倒掉。（此 步可以省略）（3）消化:每瓶加入 1mL 消化液（0.25%胰蛋白酶或 0.025EDTA 混合液 1:1）,轻 轻摇动培养瓶,经消化液铺满所有细胞表面,在倒置显微镜下待1/2 细胞变园后
9、加适量完全培养液终止。或细胞层略有松动,肉眼可观察到“薄膜”现象时,倒掉 消化液，再继续作用23分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从 瓶壁上脱落下来,在显微镜下可发现细胞回缩变圆,细胞间隙增大,此时应立即 终止消化）。在37或 25以上环境进行消化。（4）终止：加入完全培养基适量（通常10-20%胎牛血清培养基）5ml，用吸管反 复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时 动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤。（5）离心：离心（1100rpm）沉淀细胞（5-10分钟），去除培养基（含胰酶及EDTA）。（6）计数:离心前先滴好计
10、数板待计数，计算细胞的浓度。（7）传代或冻存：离心后用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养（可 1:3 至1：5传代，在25cm2的培养瓶中长满细胞可达5* 106/ml，经10倍稀释每瓶达 105/ml 即可， 25cm2 的培养瓶每瓶 5ml 培养液）。或用冻存液调整浓度（一般达 1*107）冻存。（ 到此步时经证实未被细菌或真菌污染，则撤去抗生素，以免对细 胞的生长长生不利影响，指原代培养细胞）四细胞冻存：细胞冻存液：20% 小牛血清10% 二甲基亚砜 DMSO70% 培养液操作步骤：1. 选对数增生期细胞（证明无支原体污染），在冻存前一天换液。2. 按常规方法把培养细胞制成悬液，计
11、数，使细胞密度达5* 107/ml左右，离心, 去上清液。（冻存细胞数量要充分，密度达5* 107/ml，在溶后稀释20倍时， 仍能保持5* 105ml数量）。一般25cm2的培养瓶满瓶才达到105.3. 加入配置好的冻存液，与去上清液相同的量一滴一滴的加入离心管中，让侯 用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞室培养液中加入保护剂 10%二甲亚砜 （DMSO）或甘油，可使冰点降低，使细胞内水份在冻结前透出细胞外。（细胞冷 冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSP和90-95%原来的细胞生长用 之新鲜培养基均匀混合。注意由于DMSO稀释时会释放出大量热能，故不可将 DMSO 直接加入细胞液
12、中，必须使用前先行配制完成）4. 分装于无菌冻存管中，每管1.5ml悬液。5. 旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标志。6. 冻存：1）冰箱4C放2小时，-75C过夜，转液氮保存，2）4，0，-20。各30分钟（现代分子生物学实验技术P647），最后直接放 入液氮中保存或-80冰箱保存。附件一、培养细胞的生长状况观察（一）细胞计数操作规程胎盘蓝法原理：（产品批号：T8154，T6146和Z35,962 9）使用胎盘蓝染色决定血细胞总数和活细胞数目，胎盘蓝是用于染色的多种染 料中能被活细胞排斥的一种染料，这种方法的成立是基于活细胞不能被染色：胎 盘蓝对血清蛋白比细胞蛋白有一种更强的亲和力，如
13、果背景太深，在计数之前细 胞应成球状并重悬在无蛋白的培养基或盐液中。方法：1、预先在平衡盐液中悬浮细胞（例如：Hank s平稳盐液HBSS，产品批号：H2513）2、 取0.5ml 0.4%胎盘蓝于一试管中，加0.3ml （HBSS和0.2ml细胞悬液（稀 释倍数=5）并且混匀，允许放置5 15分钟。注意：如果细胞在胎盘蓝中暴露时间过长，活细胞也会像死细胞一样被染上色。3、在血细胞计数板上盖上盖玻片，使用巴斯德毛细吸管或其它合适的器材取少 量的胎盘蓝细胞悬液于血细胞计数板上的两个小室中。将巴斯德毛细吸管小心的 靠在盖玻片边缘，利用毛细张力充满小室，不要过度或过少充盈。1）从血细胞计数板的一个小
14、室开始，计数中间和四角边长 /mm 的正方形中的所有细胞数（详见sigmaP1845的图样I）死细胞被染成蓝色，分别计数活细胞和 死细胞数。注意：压线细胞的计数原则，数上不数下，数左不数右（详见 sigmaP1845 的图II）2）重复上述步骤计数第 2个小室 注意：如果超过10%的细胞成串，应重复全部程序通过吹打务必使细胞在原液中 和在胎盘蓝细胞悬液中一样分散，如果在 10个正方形方格中细胞数少于 200 个 或多于500 个（2050 个细胞/正方形）应重复这个步骤，以调节细胞稀释倍数。3）准备第二份样品并重新计数以保证准确4）细胞计数血细胞计数板上盖好盖玻片的每个正方形（指中央大方格，其
15、长 度宽度均为1mm的正方形，与盖玻片的距离为0.1mm）,总体积为0.1mm3或10-4cm3。若1cm3近仍等于1ml，那么每毫升中集中的细胞数（和细胞总数）则可以这样来 计算。每毫升细胞数=每个正方形的平均细胞数x稀释倍数x104 （10个正方形的 细胞计数）例：如果每个正方形的平均细胞数是45x5x104=2.25x106个细胞/ml总细胞数=每毫升细胞数x最初的细胞样品的体积例：2.25x106 （个细胞/ml） x10ml （最初体积）=2.25x107个细胞（总细胞）5）活细胞比例（%）=总的活细胞数（没染上色的）一总的细胞（染上色的和没 染上色的） x100例：如果每个正方形中没染上色的（活的）细胞平均数是37.5，总活细胞数= （37.5x5x104）活细胞数/mlx10ml （最初体积）=1.875x107个活细胞，活细胞 比率（）=1.875x107 （活细胞数）一2.25x107（总细胞数）x100 = 83%.血球计数板的使用16 乂5型的计数板将计数室放大，可见它含16中格，一般取四角：1、4、13、16 四个中方格（100 个小方格）计数（见图二）。将每一中格放大，可见25个小格。计数重复 3 次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：酵母细胞个数/ 1mL=100个小方格细胞总数/ 100
