第十五章 激光拉曼光谱分析

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1、第 15 章 激光共焦显微拉曼光谱分析拉曼散射是印度科学家Raman在1928年发现的，拉曼光谱因之而得名。光和介质分子相 互作用时会引起介质分子作受迫振动从而产生散射光，其中大部分散射光的频率和入射光的频 率相同，这种散射被称为瑞利散射，英国物理学家瑞利于1899年曾对其进行了详细的研究。在 散射光中，还有一部分散射光的频率和入射光的频率不同。拉曼在他的实验室里用一个大透镜 将太阳光聚焦到一瓶苯的溶液中，经过滤光的太阳光呈现蓝色，但是当光束再次进入溶液后， 除了入射的蓝光之外，拉曼还观察到了很微弱的绿光，拉曼认为这是光与溶剂分子相互作用产 生的一种新频率的光谱线。因为这一重大发现，拉曼于19

2、30 年荣获诺贝尔物理学奖。拉曼光谱得到的是物质的分子振动和转动光谱，是物质的指纹性信息，因此拉曼可以作为 认证物质和分析物质成分的一种有力工具。而且拉曼峰的频率对物质结构的微小变化非常敏感， 所以也常通过对拉曼峰的微小变化的观察，来研究在某些特定条件下，例如改变温度、压力和 掺杂特性等，所引起的物质结构的变化，从而间接推出材料不同部分微观上的环境因素的信息， 如应力分布等。拉曼光谱技术具有很多优点：光谱的信息量大，谱图易辨认，特征峰明显；对样品无接触 无损伤；样品无需制备；能够快速分析、鉴别各种材料的特性与结构；激光拉曼光谱仪的显微 共焦功能可做微区微量以及分层材料的分析（1 tm左右光斑）

3、；能适合黑色和含水样品以及高 低温和高压条件下测量；此外，拉曼光谱仪使用简单，稳固而且体积适中，维护成本也相对较 低。激光拉曼光谱是激光光谱学中的一个重要分支，应用十分广泛。在化学方面应可应用于有 机化学、无机化学、生物化学、石油化工、高分子化学、催化和环境科学、分子鉴定、分子结 构等研究；在物理学方面可以应用于发展新型激光器、产生超短脉冲、分子瞬态寿命研究等， 此外在相干时间、固体能谱方面也有及其广泛的应用。15.1 基本原理入射光与物质相互作用时除了发生反射、吸收、透射以及发射等光学现象外，还会发生物 质对光的散射作用。相对于入射光的波数，散射光的波数变化会发生三类情况。第一类为瑞利 散射

4、，其频率变化小于3 X 105Hz，波数基本不变或者变化小于10-5 cm-1；第二类为布里渊散射， 其频率变化小于3 X 109Hz，波数变化一般为（0.12） cm-1；第三类频率改变大于3X1O1oHz，波 数变化较大，这种散射被称为拉曼散射。从散射光的强度看，最强的为瑞利散射，一般为入射 光的10-3，最弱的为拉曼散射，它的微分散射面积仅为10-30 cm2mol-1sr-1,其强度约为入射光的 10-10 左右。经典的物理学理论认为，红外光谱的产生伴随着分子偶极矩的变化，而拉曼散射则伴随着 分子极化率的改变，这种极化率的改变是通过分子内部的运动（例如转动、振动等）来实现的。虚态5ff

5、llS-lb1rMl W叱hvJf1p不同于经典的物理学理论，量子理论认为，入射的光量子与分子之间的碰撞，可以是弹性 的也可以是非弹性的。拉曼散射是光量子与分子之间发生的非弹性碰撞过程。在弹性碰撞过程 中，散射光的频率保持恒定，分子与光量子之间没有能量交换，这就是瑞利散射，如图15-la 所示。但是，一旦分子和光量子之间发生了非弹性碰撞，它们之间就会有能量交换，这种能量 交换可以是光量子转移一部分能量给散射分子，也可以是光量子从散射分子中吸收一部分能量， 不管是其中的哪一种情况，都会使散射光的频率相对于入射光发生改变。图15-la，15-lb中， E1和E2分别表示分子的初始态和终态的能量，光

6、子吸收和放出的能量只能是散射分子两个定态 之间能量的差值厶E=E2-E。如果光量子将一部分能量传递给散射分子，光量子能量变低，此时 光量子将会以较小的频率散射出去，其频率为v=v0-A v,称为斯托克斯线。对于散射分子而言， 接受光量子的能量同时跃迁到激发态e2。如果散射分子已经处于振动或转动的激发态e2,入射 的光量子将可以从散射分子中取得能量AE （振动或转动能量），并以更高的频率散射，这时的 光量子的频率为W=v0+A v,称为反斯托克斯线。因此，在拉曼光谱谱图中会出现三种类型的线（图15-2）,分别是瑞利散射线，斯托克斯线 和反斯托克斯线。瑞利散射线位于中央，频率为v0,其强度最强；高

7、频的一侧是反斯托克斯线， 与瑞利线的频差为Av,低频一侧的是斯托克斯线，与瑞利线的频差也为Av。斯托克斯线和反斯 托克斯线通常都被称为拉曼线，两者对称的分布在瑞利线的两侧，其强度比瑞利线的强度均要 弱很多，约为瑞利线强度的几百万分之一。和斯托克斯线相比，反斯托克斯线的强度又要弱很 多，这是因为大多数的散射分子处于基态，因此在拉曼谱图中很不容易观察到反斯托克斯线。 拉曼散射频率常表示为v0土Av, Av称为拉曼频移，其数值取决于散射分子内部振动和转动能级 的大小，因此拉曼光谱的频率不受激发光频率的限制。通过拉曼频移，我们可以很好的鉴别和 分析散射物质。尽管拉曼频移与激发线的频率无关，但是其强度与

8、入射光的频率是有关系的。 因此为了获得质量较高拉曼谱图，选择合适的激发线也是非常重要的。图15-2散射光的频率分布15.2基本构成及其工作原理在检测拉曼散射光时，不可避免的会收到强度大于拉曼散射至少一千倍的瑞利散射光的干 扰。提高入射光的强度，可以提高拉曼散射光的强度，但是也会提高瑞利散射的强度。因此， 在拉曼光谱仪的设计和使用过程中，既要考虑增强入射光的光强，又要尽可能的抑制和消除来 自瑞利散射的背景杂散光，从而最大限度地收集拉曼散射光，提高仪器的信噪比。典型的拉曼 光谱仪由图15-3所示的五个部分构成。图15-3拉曼光谱仪的基本结构15.2.1 光源目前拉曼光谱仪的光源己全部使用激光光源。

9、入射光采用激光，具有强度高、单色性好、 方向性好以及偏振性能优良等优点，应用于拉曼光谱仪的激光线的波长已覆盖紫外到近红外区 域，例如氩离子激光器可以提供514 nm的激光，Nd:YAG激光器可以提供1064 nm的激光。15.2.2外光路为了更有效的激发样品，收集散射光，外光路常包括聚光、集光、滤光、样品架和偏振等 部件。(1) 聚光：聚光的目的是增强入射光在样品上的功率密度。通过使用几块焦距合适的会聚 透镜，可使入射光的辐照功率增强约105倍。(2) 集光：为了更多地收集散射光，通常要求收集透镜的相对孔径较大，一般数值在1左 右。对某些实验样品可在收集镜对面或者照明光传播方向上添加反射镜，从

10、而进一步提高收集 散射光的效率。(3) 滤光：在样品前面和后面均可安置合适的滤光元件。前置的单色器或干涉滤光片，可 以滤去光源中非激光频率的大部分光能，从而进一步提高激光的单色性。在样品后面放置的干 涉滤光片或吸收盒可以滤去瑞利线的大部分能量，从而提高拉曼散射的相对强度。安置滤光部 件的主要目的是为了抑制杂散光以提高拉曼散射的信噪比。(4) 样品架：样品架的设计一方面要保证能够正确和稳定的放置样品，另一方面要使入射 光最有效照射和杂散光最少，特别是要避免入射激光进入光谱仪的入射狭缝，干扰散射光的检 测。目前入射光光路和收集散射光方向的不同，样品架光路系统的设计可以分为垂直，斜入射, 背反射和前

11、向散射等。(5) 偏振：和荧光发射光谱一样，拉曼光谱除了对散射分子进行拉曼频移以及拉曼强度的 测量，还可以通过测量拉曼光谱的偏振性更好的了解分子的结构。在外光路中加入偏振元件， 可以改变入射光和散射光的偏振方向以及消除光谱仪的退偏干扰。色散系统是拉曼光谱仪的核心部分，它的作用是将拉曼散射光按频率在空间分开。通常分 为色散型和非色散型两种。前者包括法布里-珀罗干涉仪和光栅光谱仪，后者以傅立叶变换光谱 仪为代表。目前主要使用光栅色散型光谱仪。光栅的缺陷是仪器杂散光的主要来源。15.2.4 接收系统 拉曼散射信号可以通过单通道和多通道两种方式接收。目前以电荷藕合器件图像传感器CCD （Charge

12、Coupled Device）为代表的多通道探测器被广泛应用于拉曼光谱仪。15.2.5 信息处理与显示 微弱信号的处理方法包括相干信号的锁相处理，重复信号时域平均处理，离散信号的统计 处理以及计算机处理。目前主要通用的是采用后两种方法相结合。最后通过记录仪或者计算机 接口软件输出图谱。15.3 实验技术拉曼频移不随入射光频率变化，只与样品分子的振动转动能级有关。其强度可表示为：9 = S 9 LHN4兀 sin2（a /2）（15-1）k k 0式中，申在垂直入射光方向上收集到的拉曼散射光通量（W）； S拉曼散射系数，约为 10-2810-29 mol sr-1； （p厂入射光照射到样品上的光

13、通量（W）； L与折射率和样品内场效应等因 素相关的系数；H样品被检测的体积；N单位体积内的散射分子的数目； 拉曼光束在聚 焦透镜方向上的半角度。利用公式15-1，可对散射分子的结构和浓度进行分析和研究。拉曼光谱和红外光谱均属于分子振动和转动光谱，红外光谱解析中的定性三要素（吸收频 率，强度和峰形）对拉曼解析也适用。在许多情况下，拉曼频率位移的程度正好相当于红外吸 收频率。因此红外测量能够得到的信息同样也出现在拉曼光谱中。但由于这两种光谱的分析机 理不同，在提供信息上也是有差异的，极性官能团的红外谱带较为强烈，而非极性官能团的拉 曼散射谱带较为强烈。例如，在许多情况下，C=C伸缩振动的拉曼谱带

14、比相应的红外谱带强烈， 而 C=O 的伸缩振动的红外谱带比相应的拉曼谱带更为显著。此外，分子的对称性愈高，拉曼光 谱与红外光谱的区别就愈大。拉曼光谱技术具有自身的优点：制样简单，气体样品可采用多路反射气槽测定。液体样 品可装入毛细管中测定，不挥发的液体可直接用玻璃瓶装盛测量，固体粉末可直接放在载玻片 上测试；由于激光束的直径较小，且可进一步对焦，因而微量样品即可测量；水是极性很 强的分子，红外吸收非常强烈。但水的拉曼散射却很微弱，因而这对生物大分子的研究非常有 利，此外玻璃的拉曼散射也较弱，因而玻璃可以用做窗口材料；对于聚合物大分子，拉曼散 射的选择定律被放宽，拉曼谱图上可以得到丰富的谱带；拉

15、曼光谱的频率不受单色光频率的 影响，因此可根据样品的性质而选择不同的激发光源，对于荧光强的一些物质可以选择长波长 或短波长的激发光。图15-4 Renishaw （inVia）激光共焦显微拉曼光谱仪实验室使用的是Renishaw （inVia）激光共焦显微拉曼光谱仪，由英国雷尼绍公司生产（见 图15-4）。主要性能参数：可见光614 nm）和近红外（785 nm）激光器及光路各一套，低波数 到100 cm-1,采用三点精确机械定位方式，计算机控制不同波长滤光片之间的自动转换。自动 xyz三维平台，最小步长为0.1 pm,采用光栅尺反馈控制，确保高重复性，重复精度小于0.2 pm, 可进行分散的

16、多点、线、面的扫描和共焦深度扫描。具体实验操作步骤如下：1. 开机1）打开主机电源2）计算机电源3）显微镜电源4）将使用的激光器电源a. 4nm/633nm :打开控制模块电源开关- 打开控制模块钥匙- 打开功率显示模块钥匙。b. 325/780n m：直接打开激光器电源开关。5）将Interlock盒开关选至所用激光器位置。2. 自检1）用鼠标双击Gramns图标，进入仪器工作软件环境。2）点击菜单中的Collect命令，选择System check命令执行（或Collect-System Setup-General-Check Positions），系统将自动检查所有的电机。时间大约要3-5分钟。3）用50倍物镜