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1、法医实验室几种常用 DNA提取方法及比较-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company Onel法医实验室几种常用 DNA 提取方法及比较（一）ChelexlOO 法原理：ChelexlOO是一种螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，起着螯合基团作用，对多价金属离子有极强亲和 力。在低离子强度、碱性及100C煮沸条件下，可以使细胞膜裂解，并使与 DNA 结合的蛋白质变性， DNA 游离。检材基质中一般含有大量金属离子，在低 离子强度及加热条件下，金属离子可以辅助脱氧核糖核酸酶降解DNA,也可以 抑制PCR反应，所以在提取DNA时，加入ChelexlO
2、O，螯合了金属离子，防止 了 DNA降解，提高了 PCR扩增成功率。方法：剪取适量血斑、精斑、汗斑、鼻涕斑、指甲、毛根、软组织等等生物检材，置于离心管内，加入适量纯水，室温浸泡，13,OOOrpm离心5min，上清丢 弃，管底留约2O 口丨左右液体及检材基质，加入1OO-2OO 口丨5%Chelex1OO（有时需 加适量 PK）56C15min 至数 1O 小时不等，1OOC8min，13,OOOrpm 离心 5mim， 上清备用。评述：1、Chelex1OO法已经成为DNA提取的基本方法，Chelex1OO法是万能的。目前，我们一切 纯化方法都在Chelex1OO法的基础上进行，Chelex
3、1OO法又不是万能的。2、Chelex1OO 法提取前的检材清洗非常重要，因为现场检材往往均较脏，脏东西可以抑制 PCR反应，所以往往不止清洗一次，清洗检材时可能损失部分DNA。所以应平衡清洗 抑制剂与损失 DNA 之间的关系。特别强调清洗时应“把根留住”，很多情况下已知样 本DNA检验失败的原因是把根没有留住。DNA检验时还有另外一句名言：“一个萝卜 一个坑”，防止混乱检材。肝素抑制 PCR 反应，血红素抑制 PCR 反应，所以长时的浸 泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血红素。在已知样本多次无检验结果疑为肝素抗凝 的情况下，多洗是检验成功所必须的。血红素对普通 Taq 酶的抑制作用是明显的，而
4、 目前mtDNA扩增一般用普通Taq酶，所以同一样品除进行STR检验外尚需进行mtDNA 检测时，尽量去除干净血红素，显得尤为重要。现场提取毛发或样本毛发，用毛根进 行 STR 检验时，纯水清洗也非常重要，如果没有清洗干净，毛根 DNA 本身很少，很易 检出为混合型。因为现场毛发及样本毛发很易粘附另一人成份。毛根清洗的特点为振 荡洗涤，不离心，多换水。3、 清洗后检材中加入5%Chelex1OO量视检材而定。检材参考加入量X血斑 150ul-200ul二步法精斑 1OOul毛根1Oul烟头3O-5Oul4、对于组织，难溶检材，有疑问检材，均可加入终浓度为100ug/ml左右PK,有时间隔一 段
5、时间，补加适量PK，PK（蛋白水解酶K）作用最佳pH为。5、加入Chelex1OO后，56C浸泡时间，血斑215min;组织230min,二步法精斑三1h。6、PCR扩增前应离心。PCR扩增时不应吸入ChelexlOO,因为ChelexlOO为PCR抑制剂。7、ChelexlOO使用浓度5%,有些人用10%,有些人用20%，各人爱好。配制好5%Chelex100 pH应在1011之间，否则应丢弃，不应人为调整ChelexlOO悬液pH值。（二）有机法原理：有机法提取DNA般是指用平衡酚（又叫饱和酚）、氯仿等按不同比例混合，采用不同方法提取DNA。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂，蛋白质分子表面带
6、有亲水性基因，很 容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能够顺利地进入到水溶液 中，形成稳定的胶体溶液。在有机溶剂存在的情况下，破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 使蛋白质变性沉淀，离心后，有机溶剂于试管底层（有机相），DNA继续稳定的存在于上层水 相，蛋白质沉淀存在于两相之间。水相中的DNA在大量冷无水乙醇及单价阳离子存在的情 况下，水会溶于乙醇中，而DNA从水相中析出，沉淀，通过离心回收。有机法中常用试剂 为平衡酚、氯仿，酚及氯仿作用是使蛋白质变性，氯仿的另一作用是有助于水相与有机相 分离，并抽提溶于水中（有时达12%）的酚。平衡酚、氯仿及乙醇，三者互溶。方法：剪取适量检材，置
7、于离心管内，清洗方法同用Chelex100法提取DNA，加入适量纯水及终浓度为100ug/ml PK，37C-56C孵育15min至数10小时，有时间隔一段时间补加适量 PK - 13,000rpm 5min -吸上清于另一管一加入等体积平衡酚一振荡或颠倒彻底 混匀 -13,000rpm 5min -吸上清水相于另一管，加入等体积1： 1混合平衡酚：氯仿 - 振荡或颠倒彻底混匀 -13,000rpm 5min - 吸上清水相于另一管 -加入等体积氯仿 - 振荡或颠倒彻底混匀 -13,000rpm 5min - 吸上清水相于另一管 -加入倍体积冷无水乙醇冷冻保存10min以上一13,000rpm
8、 5-10min 弃上清一室 温凉干或100 C 5min烤干加入10-20卩l纯水室温溶解或100C5min帮助溶解 离心上清备用评述：1、有机法是经典DNA提取方法，目前国内外仍大量采用，其提取DNA特点为双链，纯度 高。2、有机法缺点是应用有毒有机试剂，对人体有害，污染环境；多次换管，容易引起检材污 染及编号混乱。有机法提取DNA的另一个缺点是不能去除某些染料，血红素等，而这些恰 好是PCR抑制剂。（三）磁珠法原理：（异）硫氰酸胍（GuSCN）是强烈蛋白变性剂，不破坏蛋白质一级结构，能破坏细胞膜 及核膜蛋白，并使核酸酶失活，释放DNA。磁珠可以特异性吸附DNA，与DNA结构及片段大 小无
9、关。通过洗涤液洗涤，在仅留有特异吸附DNA的磁珠中加入洗脱液，65C解离后， DNA释放于洗脱液中。方法：5%Chelex100提取DNA上清液或者用裂解液直接提取骨骼、指甲、毛发 DNA上清液等约移于离心管内T加入结合液100ul，磁珠5ul T振荡混 匀，室温5min -在磁架上吸弃上清- 加入洗涤液I 300ul T振荡混匀-在磁架上吸弃上清- 加入洗涤液II 300ulT振荡混匀- 在磁架上 吸弃上清T加入洗涤液II 300ul T室温放置2 min干燥T加入30-50山 洗脱液，振荡混匀T 65C 10mi n T速于磁架上吸上清于另一新离心管 内，备用。评述：1、磁珠法优点是简便、
10、快速，不使用有机溶剂，安全无毒。且经过笔者验证， 磁珠法灵敏度非常高，于一根放置月余的带毛囊的毛发中成功提取到DNA且后 期的STR分型检测中成功检测到19个位点。由此可见，磁珠法非常适用于微量及 疑难检材的DNA提取。2、磁珠法与离心柱法比较，前者简单、方便，转移离心管次数较少，不易污染，而后者则 正好相反。3、目前磁珠法已被广泛地用于法医DNA实验中，国内的品牌主要有洛阳惠尔纳米科技有限 公司的法医样本DNA试剂盒，该品牌生产的磁珠稳定性、灵敏性均居于世界前列，与国外 某些品牌相比提取和纯化效果也毫不逊色。（四）盐析法1988年Miller等报导经典盐析法提取血液DNA，其方法为溶解红细胞
11、后，离心沉 渣用PK消化，用大约6M饱和NaC l沉淀蛋白质，离心上清中DNA用无水乙醇沉 淀，用TE溶解。（五）NaO H法原理：强碱溶解、变性蛋白质，破坏细胞膜及核膜，变性核酸酶，释放DNA，NaO H不破坏DNA 一级结构。方法：1、试剂配制裂解 buffer NaOH 中和 buffer Tris-HCL2、实验步骤5山或1x1mm血斑T加入450卩l纯水T室温或37C15-30min - 13,000rpm 5min - 弃上清- 沉淀中加入20山NaOH （全血 室温5mi n血斑75C5mi n）T 加入180山Tris-HCL T 振荡混匀，离心上清备用评述：1、一般认为碱性法
12、提取DNA的主要缺点是DNA保存于碱中不稳定，4C放置24h后PCR扩增 往往失败。NaOH法提取DNA STR检测不稳定（4C保存24h后PCR为阴性）的主要原因是NaOH 未完全破坏DNA酶及DNA与蛋白质重新结合。2、碱性法提取DNA的局限性。烟头、邮票、口腔擦拭物、精斑、血斑、指甲等 均可用碱性法提取，但是毛根、软组织等不能用NaO H法提取。（六）五种DNA提取方法的比较1、Chelex100法及碱性法的优点是DNA提取时间短，单管，检材不易污染，缺点 是提取DNA纯度不高。碱性法与Chelex100法比较，前者成本更低，缺点是提取 DNA保存时间短，室温不超过7天，4C及冷冻保存8
13、4天后均无法成功检见Amel 及STR位点。因为碱性法及ChelexlOO法均方便简单，提取DNA时间短，尤其适宜 于建立DNA罪犯数据库及已知样本DNA检验。2、有机法及磁珠法优点是提取DNA浓、纯，尤其适宜于特殊生物检材，微量疑 难生物检材DNA提取。有机法缺点是提取过程复杂，耗时，多管，检材易污 染，及有机试剂污染环境、伤害人体。磁珠法提取简单快捷，安全无毒，且无 需频繁移管，检材污染可能性小，尤其适用于微量检材。而且可配合工作站进 行全自动操作，大大提高了提取的效率。3、盐析法的优点包括便宜，不用有机试剂。缺点是不易提取微量检材。（七）DNA提取几种常用试剂作用及浓度1、PK破坏蛋白质一级结构，使蛋白质成碎片，贮存浓度一般为5mg/ml，使用 终浓度一般为100g/ml，有时提取骨骼DNA的PK终浓度达ml。PK最佳pH值为。2、SDS既是蛋白变性剂又是表面活性剂（去垢剂），有变性蛋白质及保护蛋白质 的双重作用，所以可以理解PK与SDS混用而不会破坏PK的原因。贮存液浓度 10%,使用终浓度一般为1%。Trit on、Twee n与SDS作用相似。3、EDTA能螯合金属离子，防止脱氧核糖核酸酶降解DNA。
