真菌分离以及培养

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1、、(越南进境人参果炭疽病病原菌的分离鉴定2009年第3期 植物检疫胡佳 王卫 芳)1、病原菌分离采用组织分离法，取病果病健交界果皮组织分离培养(马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA，25C,1 2 h荧光与1 2 h黑暗循环交替)，病菌纯化后保存备用。2、病原菌培养特征和形态观测取病果病部组织进行徒手切片，显微观察分生孢子盘和分生孢子的形态特征；观察病菌的 培养特性(P D A, 2 5 o C, 1 2 h荧l 2 h黑暗循环交替)；观测分离物分生孢子的形态和大小； 从培养7 d的菌落中挑取分生孢子团，配制成孢子悬浮液，采用载片悬滴法，观测附着 孢的形态及大小。3、 病原菌1 8 S r D N A

2、序列扩增与测定将纯化菌株置于P D A、2 5 o C、1 2 h荧/ 1 2 h 黑暗循环交替条件下培养5d，挑取菌落边缘新鲜菌丝，采用常规CT A B法提取病原菌 基因组D N A作扩增模板，进行P C R扩增。所用引物为真菌1 8 S r D N A通用引物G e o A 2和G e o l 1【9 J。反应体系为2 5总体积，d d H 2 O 1 6 .3 7 5，1 0倍P C R缓 冲液(含 Mg C 1 2 ) 2 . 5 I x L，d N T P( 2 . 5 mm o l / L) 2 L，G e M1 ( 1 0 I mo l / L ) 1 L， G e o A 2

3、( 1 0 l x m o L / L ) 1 LT a q ( 5 u / l x L ) 0 . 1 2 5 L，模板 D N A 2 L。反应程序为 9 4 C 预变性 2 m i n，9 4 o C 4 5 s， 5 5 o C 4 5 s， 7 2 o C2 mi n， 3 0个循环，7 2 C延伸1 0 mi n， 4 C保存。P C R产物送上海英骏生物有限公司 纯化测序。测序结果与G e n B a n k数据库中的已知序列进行B L A S T比较。4、致病性测定选取健康柑橘(C i t r u s r e t i c u l a t a)、苹果(Ma l u s p u m

4、i l a )果实，经 7 0 % 酒精表面消毒后晾干备用。 从在P D A、2 5 o C、1 2 h荧光/ 1 2 h黑暗循环交替条件 下培养7 d的菌落上挑取分生孢子团，用无菌水配成分生孢子悬浮液(1 0 0倍镜下5 06 0 个孢子)。用灭菌针刺伤果皮，用无菌滤纸片沾取孢子悬浮液覆盖在针刺部位接种，以无 菌水作对照。用保鲜膜分别包裹接种果和对照果，封口，放置经7 0 %酒精消毒过的塑 料箱中，于2 5 o C、1 2 h荧光/ 1 2 h黑暗条件下保湿培养，定期观察症状发展过程。发病的果实按照2的方法重新分离病原菌，做K o h n法则确认是否同种致病菌。二、(苹果炭疽菌低毒性菌株的筛

5、选及控病效果的研究)炭疽菌培养参照方中达等的方法在含有PDA培养基的试管斜面上接种炭疽菌，7d后用10mL 无菌水冲洗抱子再倒入25OmL内有玻璃珠、灭菌的三角烧瓶中(约1又1 了个抱子/mL)，置 摇床上20min，使抱子团充分分散，涂平板12个待用。涂平板仍参照方中达的方法苹果炭疽病菌在pH310范围的PDA培养基上均能生长和产抱，最适菌丝生长的PH值为4， 分生抱子产生的最适pH值为45，三、(东北农业大学农学硕士学位论文南瓜疫病菌(尸彻toPhthor。aP:iciLeon.)毒素致病机 理及抗源筛选研究)生物测定法包括幼苗浸渍法、离体叶片浸渍法、叶片针刺、涂抹和喷雾测定、植物愈伤组织

6、 测定法、离体根冠细胞测定法、线粒体测定法、叶绿体测定法、细胞膜测定法等。酶水平的生物测定有ATP酶法、PAL酶法、核糖核酸和脱氧核糖核酸酶法、SOD酶法、POD 酶法、MOD酶法。代谢水平的生物测定有种苗偶联能量的测定、苯丙烷类代谢途径的测定、 离子吸收测定和C02暗固定测定法等。与抗性有关的重要的酶类有细胞壁水解酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚 氧化酶(PPO)等，植保素为一些酚类和黄酮类化合物。2.2.1液体培养基制备Plich S 培养液:I000ml 培养液中含 KH2PO4 5g, MgSO4; 7H2O 2.0g，天门冬酰胺 1.0g, VB1 0.1g，

7、酵母浸膏5g，蔗糖25g;灭菌前PH调至6.5。胡萝卜汁培养液:用200g胡萝卜切碎后，煮沸30分钟，经2层纱布过滤后用蒸馏水定容至100Oml)。灭菌前州调至6.5。2:2粗毒素的提取2.2.2.1产毒培养菌株移接于CA平板上，于24条件下培养7d后，沿菌落边缘打出直径为smm菌块，接入 分别装100mlphchs培养液及胡萝卜汁培养液的250m!的三角瓶中，每瓶接5块，置于25C 条件下振荡培养巧d，培养液经定性滤纸过滤，滤液经细菌滤膜真空抽滤得无菌培养液。2.2.2.2粗毒素的提取在无菌培养液中加入(NH4)SO4;置饱和度达85%(0oC)沉淀过夜，再经11000 r/min离心15m

8、in， 沉淀溶于去离子水中，4C下对去离子水透析24小时即可得到粗毒素一 20C下保存备用。2.2.3培养基对P.C月pSl cj产毒能力的影响2.2.3.1根长生长抑制法用在两种培养基培养得到的无菌滤液分别接种，接种方法是将感病品种(DX l)的种子用清 水漂洗汰除病、劣和杂粒，加水浸泡8小时后，倒掉水并用水冲洗几遍再放到25 一 26C恒 温条件下培养。待主根长为Znun时，胚向下摆在事先已铺有用无菌滤液浸湿的纱布的白瓷 盘内，每白瓷盘放50粒种子，再在种子上面覆盖一层用滤液浸湿的滤纸，于温度为26C的 温箱中培养48小时后测量主根长并计算根生长抑制率。每个处理3次重复，并设置无菌水、空白

9、培养液作 对照。生长抑制率(%)二对照处理根长X1002.2.3.2幼苗浸渍法用两种培养基提取的无菌滤液分别处理幼苗，鉴别无菌滤液的活性。接种时期为第一片真叶 完全展开，第二片真叶1/2展开的幼苗，经无菌水处理后，移入分别盛有两种无菌滤液的三 角瓶中，设p。caPsl ci无菌水、空白培养液做对照，24 一 26C刻牛下，光照处理下，每 个处理5次重复，两天后观察其发病症状。四、(辣椒疫霉菌产毒培养方式和提取方法的研究李海燕。赵伟全第16卷第1期黑龙江八 一农垦大学学报16 (1)： 1013 2004年3月)采用Plich s培养液在振荡培养的方式下，辣椒疫霉菌(Phytophthora c

10、apsici)产毒量最高。大量快速提出Phytophthora capsici毒素的最佳方法为硫酸铵沉淀法1.2试培养基Plich s 培养液：KH2PO 4 0.5 g，MgSO4 - 7 H2O 2.0 g，天门冬酰胺 1.0 g，酵母浸膏 5.0g， VB1 0.01g，蔗糖 25 g，蒸馏水 1 000 mL。胡萝卜汁培养液：称取胡萝卜200 g，去皮切成小块放入组织捣碎机内捣碎裂分钟，三层纱 布过滤，滤液加蒸馏水定容至1 000 mL。辣椒叶煎汁培养液：取新鲜辣椒叶200g，加水煮 沸30min，过滤，滤液加蒸馏水定容至1000mL。1.3产毒培养条件采用胡萝4(CA)固体培养基上，

11、培养5d的辣椒疫霉菌，沿菌落边缘打出直径为8mm的 菌块，接入装有150 mL培养液的250 mL三角瓶中，每瓶8块，每种培养液接种10瓶，5 瓶于25C下静止培养，另外5瓶置于25C恒温振荡培养箱(HZQ-X100型)中振荡培养(120 r/min) 15 d。取出培养液经三层定性滤纸抽滤，再经微孔滤膜(0.45 u m)真空抽滤，得无 菌培养滤液，调pH值至6.5,置4C冰箱中待用。1.4毒素提取方法的选择取上述Plichs无菌培养滤液（每份100 mL）,按以下五种方法进行提取。1.4.1直接透析浓缩法：将100 mL无菌培养滤液装入透析袋（MW 8 00010 000,预先经10 mm

12、ol/L NaHCO31 mmol/L EDTA溶液煮沸30 min,用双蒸水充分洗涤）中，直接放入经4C 预冷的20%聚乙二醇（PEGs,MW 20000）溶液中浓缩（于4C冰箱中）。1.4.2硫酸铵沉淀法:将盛有100 mL无菌培养滤液的烧杯放在一装有冰水混合液的大烧杯内， 置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，边搅拌边徐徐加入硫酸铵固体（每100 mL培养滤液加硫酸铵 55.9 g）至85%饱合度，继续搅拌10 min,使溶液充分混合，4C过夜。1.4.3丙酮沉淀法：将丙酮提前预冷至-20C，将样品滤液置冰浴中用磁力搅拌器缓慢搅拌， 边搅拌边缓缓加入预冷丙酮（每100 mL样品加丙酮100 mL），

13、加完后继续搅拌1015 min， 使溶液充分混合，4C过夜。1.4.4乙醇沉淀法：方法同丙酮法，只须将丙酮换为无水乙醇即可。1.4.5聚乙二醇沉淀法：在冰浴条件下向100 mL无菌毒素培养滤液中加入预冷至4C的50% 聚乙二醇溶液（每100 mL滤液加50%PEG 150 mL），边加边用磁力搅拌器缓慢搅拌，持续搅 拌40 min,使溶液充分混合，4C过夜。将各处理样品用himac CR21高速低温离心机离心15 min （4C，10 000Xg）,弃去上清液，将沉淀用少量无菌双蒸水复溶，再离心除去变性蛋白。 将各蛋白样品分别装入透析袋中，于4C下无菌双蒸水透析24 h，其间每隔6 h透析液一

14、次。 最后将各提取样分别定容至3 mL，分装于1.5 mLEppendorf管中，-20C保存。1.5毒素浓度的测定采用Bradford法，即考马斯亮蓝G-250染色法。1.6毒素生物活性的检测参照谢丙炎（1997）的叶片注射毒性检测法。取在人工气候培养箱中生长至6叶期茄门甜椒 幼苗的第3、第4片叶，待测样品经透析去盐后，用无菌的一次性注射器在叶背面沿叶脉注 入25UL样品，分别以蒸馏水、未接菌的培养液为对照，每处理注射10片叶，24 h后测定 叶片坏死的严重程度，以叶片的病情指数作为毒素的相对活性。病情指数=（各叶片坏死严重率之和/调查总叶片数）X100%五、胶孢炭疽菌菟丝子专化型毒素的初步

15、研究刘 慧，袁世斌第20卷 第3期 2002年9月 四川农业大学学报胶孢炭疽菌菟丝子专化型可产生有致病力的外毒素，毒素引起菟丝子产生类似于接种分生孢 子所引起的症状。菟丝子蔗糖培养液、改良的Czapek-Dox培养液和摇瓶液体发酵培养基均 可产毒。毒素经100C水浴30 min后仍保持较高的致病率，而5 mol/L盐酸水解处理4 h后致 病率明显下降。初提纯毒素液的pH值对毒素影响较小。毒素易溶于水，难溶于多种有机溶剂, 透析实验结果表明毒素为大分子物质，推测毒素的主要成分是蛋白聚糖类物质1.2培养条件 菌种接种于PDA培养基平板中央，在28C恒温培养箱中培养7 d后，在菌落边 缘取直径为10

16、 mm的菌块接入盛有30 mL培养液的250 mL三角瓶，置28C旋转摇床振荡培 养10 d。以下每个试验设置3个重复，毒素的致病性试验设置喷雾dH2O和（或）灭菌的各种培 养液以及未经处理的粗毒素液等对照。1.2.1培养基A.改良的Czapek-Dox培养液4;B.马铃薯蔗糖培养液（PSB）:取40g去皮马铃薯，按PDA培养基的配制方法滤液加入蔗糖4 0g,定容到200 mL,pH自然;C.菟丝子蔗糖培养 液（CSB）:取40 g新鲜菟丝子种子,其它同PSB;D.摇瓶液体发酵培养基：蔗糖 2 0%,（NH4）2SO41 0% CaCl2-2H2O 0-1%,K2HPO40-1%,MgSO4-7H2O 0 03%,蛋白胨 0 1%, 玉米粉1 0%,可溶性淀1 0