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1、POU同源域蛋白的结构及其在发育中的作用综述POU(Pit-Oct-Unc)同源域蛋白是一组真核生物转录调控因子，由众 多POU同源盒基因家族成员编码，在脊椎动物和无脊椎动物中，参与胚 胎发生的早期过程，在细胞谱系的分化及神经、内分泌和免疫等多系统 发育过程中起重要的调控作用。POU同源盒基因最早是根据哺乳动物转 录因子Pit-1(存在于大鼠垂体中的一种转录调节因子)、Oct-1和Oct-2 (B 淋巴细胞转录因子)与线虫Unc-86 (线虫发育相关调控因子)都能与一段 特定序列的DNA区域结合而归族的。POU同源盒基因家族是众多同源 盒基因家族中的一组成员，具有同源盒基因的特征性结构特点，且
2、其特 殊的POU区也是转录因子与DNA结合的重要结构形式。一、同源盒基因的结构及分类1、同源盒基因的结构模式1983 年在瑞士的 Gehring 实验室， 在绘制果蝇触角足基因 (antennapedia, Antp)外显子图谱的过程中发现Antp的cDNA克隆和染色 体上距Antp基因左侧30kb部位有弱的交叉信号，并发现这一交叉杂交 顺序是 ftz 基因转录单位的一部分，很快在 Ubx 基因中也发现相同的 DNA片段。用这一片段作为探针进行杂交试验，发现在果蝇染色体上有 10 多个位点有阳性杂交信号。 DNA 序列分析表明，这些位点所属基因 均含有约183 bp的特征性核酸结构，称为同源盒
3、(homeobox, HOX)。将 含有这段同源盒 DNA 序列的基因称为同源盒基因，由同源盒基因编码 的蛋白质则称为同源域蛋白(homeodomain protein)。同源盒结构具有较高 的保守性，并保持相同的阅读框架，编码 61 个氨基酸残基的肽段，称 为同源异形域或同源结构域(homeodomain, HD)。同源结构域与螺旋一转 角一螺旋(helix-turn-helix, HTH)、锌指结构、亮氨酸拉链等结构一样， 是真核生物DNA结合蛋白中一类特殊的结构式样。接着，在具有同源异形突变现象的甲虫和属于环节动物的蠕虫等无 脊椎动物中发现了同源盒结构。随后，在脊椎动物也发现有同源盒结构
4、 存在。先是在爪蟾早期胚胎的mRNA中发现同源盒序列，后来在小鼠与 人的基因组中也找到这段特殊的DNA序列。同源域蛋白含有同源结构域和特异结构域(specific domain, SD),连 接两者的是一段长度变化较大的连接区(linker)。通常特异结构域位于同 源结构域的上游，靠近同源域蛋白的N-末端，同源结构域靠近C-末端， 这两个结构域在同源域蛋白作为转录因子发挥作用时均起重要作用。同源结构域是同源盒基因序列编码的61个氨基酸构成的肽段，是具 有高度保守性的氨基酸域。它的一个显著特点是碱性氨基酸残基高达 30%,这符合同源域蛋白是DNA结合蛋白的特点。X-射线衍射晶体学研 究表明：同源
5、结构域，折叠成3个a螺旋，在第2和第3个螺旋间构成螺旋 转角一螺旋结构，这是DNA结合蛋白的主要特征结构。同源结构域 能特异性地识别以5-TAAT-3为核心的1012bp的DNA序列。第2和第3 个螺旋间形成的浅沟结构，可以与特异的核苷酸序列结合，而第l和第2 个螺旋则为同源结构域与DNA的结合提供了空间和结构的完整性。2、同源盒基因的分类迄今已发现300多个同源盒基因，广泛分布于从酵母到人类的各种 真核生物中。哺乳动物同源盒基因根据其在染色体上的分布可分为复合 型和分散型。复合型同源盒基因在染色体上成簇串联分布，并按前后轴 (antero- posterior， A-P)的方式表达，称之为A
6、-P型同源盒基因，又称为 Hox I类基因，与Antp基因有很高的同源性( 80% )。小鼠及人类的A-P 型同源盒基因分为A、B、C、D四个簇，分别位于7、17、12、2号染色 体上的特定区域(7p14-15、17q21、12q12-13、2q31),每簇中又按基因 序列的同源性分为13个组。这一类同源盒基因统称为Hox基因，目前共 发现39个Hox基因刀。甲.ftA -补 *不円 hb pb Dfd Scr Antj UbMabdAabdBFKJM-I IOlI IJ I小赋=4一氓Al A2 A3 A4 AS AS A7 加 A10AH A13 nan&Bl B2 B3 Bl B5 B6
7、 B7 Ba B9 际 MZHZHZHZHZhdLZHZH3HcoccU C5 OSa C9 C10CI1C12C13DDCEhOQOOOBaxd-oOODlD3 D4DS DSD10IM1D12D13OHZZHZHZFQHZZF图1果蝇和哺乳动物Hbx ad同源盒基因的成簇排列，箭头表示各基因的转录方向。另一类分散型称非A-P型同源盒基因，也被称为Hoxll类基因，或歧 异Hox genes、non-Hox genes。它们不成簇排列，而是散布在不同染色体 上，与Antp基因的同源性较低( 50% )。根据同源结构域以外保守序列 的同源性分类，又可分为：eve、ems、Dll、cad、Hix
8、、msh、TLC/NEC、 NK-1、NK-2、en、prd、prd-like、cut、LIM、ZF和POU等 16种类型。它 们之间同源结构域的同源程度存在差异，分子内其他肽段差异性更大， 显示出蛋白质水平上的多样性。同源域蛋白是一大类重要的转录调控因子，作为反式作用因子，它 既可以是转录的激活子，也可以是转录的抑制子，其靶基因包括其他同 源盒基因、粘附分子、胞外蛋白和生长因子等。同源盒基因作为胚胎发 育的主控基因，在胚胎发育、细胞生长、分化、迁移和某些组织特异性 基因的表达中起重要作用8 。当同源盒基因表达调控异常会使个体发育 或组织器官在形成过程中出现异常形态结构 , 产生疾病, 严重者
9、可使细 胞恶性转化形成肿瘤。POU类型cut类型Antp、lab、ems、cad、TCLPBC结构域六肽域类型六肽 HD波纹蛋白配对域蛋白EH2 EH3 HD EH5配对结构域POU特异结构域 HD二、POU同源域蛋白的结构及与DNA的结合1、POU同源域蛋白的结构POU家族成员都有共同的结构式样，称为PO U结构域，由147156 个氨基酸组成，包括二个亚结构域及其连接区，靠近N-末端的是含69 78个氨基酸的POU特异性结构域(POU-SD),靠近C-末端是含61个氨基酸 的POU同源结构域(POU-HD)。两者之间是一段长度变化较大的连接区, 含1556个氨基酸残基910。POU-SD和
10、POU-HD偶联存在，是独立的 HTH结构单位，都直接结合到DNA序列上，与DNA的碱基和磷酸基团作 广泛的接触，两者都是POU蛋白高亲和性识别并结合特异DNA序列所必 需的8。POU蛋白的POU-HD禀承着同源盒结构的共同特点，含有3个a-螺旋 结构，螺旋II和III之间形成HTH结构9。核磁共振和X-射线衍射分析表 明如，HD在第52/53残基形成一个转折，这样可认为螺旋III形成两个螺 旋(III/W) 11，这附和某些文献中对POU-HD的描述是形成4个a-螺旋结 构。组成III、W螺旋的氨基酸残基极为保守，几乎所有的PO U家族蛋白 都含有RVWFCN序列。在POU-HD的N端和C端
11、各有一组保守的碱性氨基 酸残基:N端8个残基中有56个碱性残基,C端7个中有45个碱性残基, 这些碱性残基对于POU蛋白的DNA结合功能及转录激活是必不可少的。POU-SD分为两个亚结构域A和B，两个亚结构域的中心都含有一个 碱性氨基酸簇，使两个亚结构域分别在C-末端和N-末端都形成一个a-螺 旋结构阻，13】，这样两个亚结构域共形成4个a-螺旋结构，可形成与 POU-HD相似的立体构象。DNA BENDING DOMAINranccriptlonal AcPofnain图3： POU同源域蛋白的结构2、POU同源域蛋白DNA的结合模式完整的POU-HD对于所有的POU蛋白与特异DNA位点的识
12、别和结合 都是必需的，POU-SD主要赋予POU蛋白以DNA结合特性和调节特性。 对POU蛋白与特异DNA位点识别和结合的研究，目前对Oct-1和Pit-1的了 解较为详尽。（1）Oct-1与八聚体元件结合Oct-1蛋白对DNA八聚体元件ATGCAAAT （又称O ct序列）有高亲和 性，POU-SD结构域同5端半位点ATGC接触，POU-HD同3端半位点 AAAT接触。对复合物的结构分析表明，两个结构域分别结合于双链DNA 相反两面的大沟内网，两个结构域之间不形成直接相互作用，各以HTH 单位内的识别螺旋定位于相背的大沟内。两个结构域之间24个残基组成 的连接区，使蛋白质分子内两个结合DNA
13、的区域结合得更精确，识别更 具特异性。POU-HD在DNA大沟内与3端半位点AAAT结合。关键性的结合 由识别螺旋内Val47、Asn51和Cys50的侧链进行。Asn51与第3个A（即 A7）形成氢键，Val47与T8的甲基发生疏水性作用。Cys50是POU-HD 特有的，其 SH 基与八核苷酸之外的位点接触，其原因尚不清楚。另外 一些保守残基如 Arg5、 Thr6 和 Arg13 同八核苷酸一条主链上磷酸基团 形成氢键，Lys25、Ser48、Arg46和Arg53与另一主链的磷酸基团接触。 尽管不同POU蛋白的HD存有差异，但与DNA结合的方式却十分相似, 特别是Asn51非常保守，总
14、是同AAAT的A7相互作用，Arg53和第25 位残基（Oct-1中是Lys25）与磷酸基团形成盐键。Oct-1蛋白的POU-SD和POU-HD有着相似的立体构象，POU-SD由4 个a-螺旋组成，有高度保守的紧密的疏水核心，许多亲水性残基位于靠 近蛋白质一侧表面。Oct-1中螺旋III是识别螺旋，Thr45同ATGC序列中的 T2和C3形成氢键，Agr49同G3和G4形成氢键。如果把Arg49换成Ala，就 会破坏Oct-1对DNA的接触。Gln44同A1形成氢键。结构域内其他保守性 残基也参与接触，如Arg20和Gln27与碱基及磷酸基团的氧原子形成氢 键，使整个氢键网络更加稳定15。从O
15、ct-1分离的POU-SD和POU-HD分别与靶序列ATGCAAAT进行结 合，测定解离常数。发现单独的POU-SD结合性很弱，POU-HD的结合较 好，而含有两者的肽段结构对这一靶序列的亲和性则明显增强。如果在 DNA靶序列的ATGC位点和AAAT之间增力口 13 bp(如 ATGCAGC AAAT),亲和性就会大大降低。两个POU结构域POU-SD和 POU-HD对DNA特异位点的结合具有协同作用Ml,两个结构域之间的连 接区使得两侧的POU结构域更易于定位到八聚体元件序列上，都不可或 缺。(2) Pit-1以二聚体形式结合于DNA位点哺乳动物Pit-1蛋白以二聚体形式结合于某些基因启动子
16、元件上，复 合物晶体结构表明，二聚体亚基分别位于 DNA的两侧，同一亚基的 POU-SD和POU-HD处在DNA同一侧(见图5)。两亚基通过POU结构域介 导相互间形成偶联，一个亚基的POU-HD螺旋III的羧基端呈伸展结构， 与另一亚基POU-SD螺旋I及螺旋III、W间形成接触，相互作用形成二 聚体17。概括来说，POU同源域蛋白共有3个重要的结构区域：N端转录激活 区、POU-SD和POU-HD。POU-SD和POU-HD主要负责与靶DNA的特 异结合，POU蛋白对于靶基因的转录激活作用则依靠N端转录激活区19。 POU蛋白的N-末端被认为作为转录激活区与POU蛋白的功能密切相关， 但对它们的具体作用机制尚不
