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1、1、流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。目录* 1原理* 2 流式细胞仪(flow cytometer)* 3应用* 4参见原理一束单色光(通常是激光)照到流体力学聚焦的一股流体上。若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点， 其中一个和激光在同一直在线(称作前散射(FSC)，其它几个和激光垂直(旁散射(SSC)和一个或几个荧 光监测器)。当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所带有的荧光化合物被激发并发射出 频率低于激发光的荧光。这些散射光
2、和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动(每个细 胞会显出一个散射或荧光的峰)就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。前散射与细胞体积相关，而旁 散射取决于颗粒的内部复杂程度(比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度)。可以检测的参数有：细胞的体积和形态复杂程度、细胞中的色素、DNA (细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等)、RNA 染色体分析和分选(文库构建、染色体涂染)、蛋白质、细胞表面抗原(CD标记)、胞内抗原(各种 细胞因子(cytokine)、次级媒介等)、核抗原、酶活性、pH，胞内离子化的钙、镁，膜电势、膜流动性细胞凋亡(apoptosis)(定量检测DNA降解、线
3、粒体膜电位、通透性变化)、细胞存活能力、监测细胞电 通透性、氧爆作用(oxidative burst)、研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR)、谷胱甘 肽、各种组合(DNA/表面抗原等等)流式细胞仪(flow cytometer)流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计(FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter)。 现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。流式细胞仪和显微镜比较像，但能够对大量的单个细胞利用一组参数进行高通量的自动量化。固体组织需 要在检测前制备成
4、单细胞的悬浮液。一个流式细胞仪包括五个组成部分：*细胞流动系统：液流(鞘液(sheath fluid)携带细胞，使颗粒以串流形式通过光束。*光源：有通常的灯(汞或氙)、高功率水冷的激光源(氩、氟、染料激光)、低功率气冷激光(氩(488nm)， 红氦氖(633nm)，绿氦氖，氦镉(紫外)、偶极激光(蓝、绿、红、紫)。*检测和模数转换(analogue-to-digital conversion, ADC)系统：产生前散射、旁散射光和荧光的信号。*放大系统，线性或对数放大。*计算机，用于分析信号。早期的流式细胞仪主要是实验设备，但目前仪器和相关的试剂有了很广的市场。不同厂商的仪器特性也不 同，主要
5、的厂商和品牌如下：* Beckman-Coulter (ex-Coulter): Epics XL/XL-MCL; Epics Altra (Hypersort) (IBM-PC compatible platforms)* Becton, Dickinson: (FACSs): FACSCAlibur, FACScan, FACSort, FASCSVantage (Mac OS platform) FACS Canto, LSRII, Aria, DiVa (PC PLatform)* Cytomation: MoFlo, Cyan (IBM-PC platform)* Partec/Da
6、ko: Galaxy; PAS; CCA; PA (IBM-PC compatible platforms)应用流式细胞术在很多领域中都有应用，包括分子生物学、病理学、免疫学和海洋生物学等。在分子生物学中， 它主要用于荧光标记的抗体。特异性的抗体与靶细胞上的抗原结合，能够通过流式细胞仪研究这些细胞的 特别信息。这在医学（尤其是器官移植、血液学、肿瘤免疫学和化疗、遗传学）中具有很广泛的应用。 现代的流式细胞仪具有多个激光和荧光检测器（目前商业用仪器的记录是4个激光和14个检测器），可以 用于多个抗体标记，以便在表现型中更准确地区别某个靶群体。流式细胞仪也是很有用的分选仪器。当细胞/颗粒通过时，可
7、以被选择性地加上某种电荷，并在通过电磁场 后偏转，从不同出口流出。这样就可以从一个混合物中高速（理论上可达到每秒大约9万个细胞）准确地 分离开四类细胞。由流式细胞仪得到的数据可以画成一维的柱状图或者二位或者三维的散点图。The data coming from flow-cytometers can be plotted in 1-D to produce histograms or seen in 2D as dot plots or in 3D with newer software. The regions on these plots can be sequentially separ
8、ated by a series of subset extractions which are termed gates. Specific gating protocols exist for diagnostic and clinical purposes especially in relation to haematology. The plots are often made on logarithmic scales. Because of overlaping fluorescent dyes, emission spectrum generated interfering s
9、ignals by detectors signals have to be compensated electronically.海洋中主要的光合生物之占海洋浮游生物总细胞数将近1/3的原绿球藻（Prochlorococcus）就是通过流式细胞术发现的。因为其细胞小，叶绿素含量少，在通常的荧光观察中被迅速漂白（bleach），但由于在流 式细胞术中细胞通过光束的时间极短，胞内叶绿素的荧光可被观察到。编辑参见*荧光显微镜*荧光活化细胞分选2、流式细胞技术-细胞内细胞因子的检测（摘自免疫学论坛）流式细胞技术-细胞内细胞因子的检测 激活的淋巴细胞内细胞因子的检测简介细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞
10、应答中有重要的免疫调节作用。 细胞因子可以调节细胞生长、分化以及一系列功能，并且介导正常与病理性免疫 应答。细胞因子是具有效应及调节双重作用的独特蛋白。近来研究显示，细胞因 子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激 活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1 （IL-2, IFN- Y）与TH2 （IL-4，IL-5，IL-10），但这些研究很难外推，因为T细 胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。近来，Jung 与 Picker 采用 了 Brefeldin（BFA）与 monensin
11、 等药物预孵 检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得 细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。这一方法可检测 单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。使用特定刺 激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。在细胞水平该方法证明了 人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可 被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止 的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。胞内流式分析法基于目前BD的FastIMMUNE Cytokine System。抗细 胞因子抗体与细胞表
12、面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因 子的分泌。此分析采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞 的最小荧光背景。一、仪器设备1. 12X75mm 有盖的 Falcon 管(BD Catalog No.2058)2. 37C孵箱 5%CO23. 混匀振荡器4. 离心机5. 加样枪、Tips6. FACS流式细胞仪二、细胞1、全血使用肝素钠抗凝的VACUTAINER真空采血管(BD VACUTAINER Catalog No.367673) , FastIMMUNE不易采用肝素锂，EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小 时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳
13、性细胞会减少5%。 如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。2、自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)使用肝素钠抗凝的BD VACUTAINER细胞制备管(CPTs) (BD VACUTAINER Catalog No.362753) 24 小时内分析。3、组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)用Ficoll分离PBMCs，调节细胞浓度2X106细胞/mL于含10%热灭 活胎牛血清(FBS )的RPMI 1640。4、细胞系与T细胞克隆调节细胞浓度2X106细胞/mL于新鲜培养基中。5、冰冻全血与PBMCs应用1XFACS溶血素，溶血固定激活全血或PBMCs用PBS漂洗，并
14、用 含1%的BSA及10%的DMSO的PBS，冻存一70C。溶化后细胞置于染色管中， 加上23mL的洗液，离心5分钟500g，然后用FACS通透液 通透与染色。三、刺激试剂与抗体1、PMA (Sigma catalog No.P-8139)打开装有PMA的小筒，打开包装，取出1 mg包装的小瓶，打开迅速加 入1 ml的无水乙醇或DMSO。注意：无菌操作，PMA易挥发，有毒。然后分装到 100支1.5ml的e.p.管中，每管10ul,取出1支待用，其余99支冻存于-70C或 -20C冰箱。2、离子霉素 Ionomycin(Sigma catalog No.I-0634)打开包装内含1mg的离子霉
15、素，加入1ml的无水乙醇，然后分装到100 支1.5ml的e.p.管中，每支10ul,取出1支待用，其余19支冻存于-70C或-20C 冰箱，3、Golgistop 或 Golgiplug, (catalog No.555029 或 554724)详细请见说明书4、所需相应的抗体，如 CD4、CD8、CD3、IFN-y、TNF-a、IL-2、IL-4、CD69 等。最后在全血中的终浓度：PMA:20ng/ml全血5、离子霉素：典g/ml全血6、FACS溶血素FACS溶血素(BDIS Catalog No.349202)用于PBMCs，培养细胞与全血制备，主 要有3个作用：(1) 全血制备时用于
16、溶解红细胞(2) 固定外表位(3) 辅助通透剂FACS溶血素使用前用无离子水1： 10稀释，勿用PBS或其它缓冲液。 而且FACS溶血素必须与FACS通透液一起使用，即使是培养细胞的检测。7、FACS通透液BD推出FACS通透液(BDIS Catalog No.340973)以确保灵敏性及降 低染色背景。此试剂独特之处在于它能克服皂素等其他胞内染色常用通透剂的不 足。(由于皂素是植物提取物，组分不均一，常会带来胞内染色的变异)FACS 通透液另一优点是它能免除某些方法为增加通透性所需冷冻细胞过夜的步骤。FACS通透液使用前用无离子水或蒸馏水1： 10稀释，勿用PBS或其它 缓冲液。8、DMSO
