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1、实验五细胞核和线粒体的分离一、实验目的1、了解用差速离心的方法分级分离细胞组分的原理和过程。2、熟悉离心机、匀浆器的使用方法。二、实验原理1、分离纯化的方法为了研究某种细胞器的结构、功能或制备某种生物大分子，常需要大量采集 细胞的某些亚组分，因此，有必要分离细胞器。离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行 分离、浓缩和提纯的一种方法。主要包括差速离心、密度梯度离心等方法。差速离心：采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。被分离的分子越小，需要的离心速度越高。密度梯度离心：预先装入有一定密度梯度的材料(蔗糖或甘油)，利用各种 颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相
2、同沉降速度的颗粒处于同梯度层内。匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖溶液(0.25mol/L)。它比较接近细胞质 的分散相，具有足够的渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在 PH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。2、细胞器的鉴定细胞核一一姬姆萨染液线粒体一一詹纳斯绿B詹纳斯绿B(Janus green B)是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细 胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还 原，成为无色状态。三、实验用品1、试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖+ 0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液 (pH7.4)、0.34mol/L 蔗糖 + 0.01m
3、ol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)、1%詹纳斯绿 B 染液、姬姆萨染液2、材料：兔子肝脏3、器材：解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、尼龙织物、玻璃匀浆器4、设备：高速离心机四、实验步骤1、制备兔肝细胞匀浆：向兔血管注射空气针处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水 洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0 4园的0.25mol/L缓 冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0 4园条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤 备用。注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长， 以保持组分生理活性。2、差速
4、离心：先将3ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地 加入3ml肝匀浆使其覆盖于上层。用冷冻控温高速离心机按图顺序进行差速离 心。分离细胞核兔肝匀浆I过滤I滤液（涂片一张）（各种细胞器）I滤液3ml覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上J*上清液一作涂片（线粒体及碎片）I 10000 g离心10 min，弃上清液沉淀（线粒体）I加预冷0.25mol/L蔗糖液，吹匀混合液I 10000 g 离心 10 min沉淀（线粒体）上清液（较轻物质）II作涂片作涂片700xg 离心 10min沉淀（细胞核及碎片）I加0.25mol/L预冷蔗糖液至5ml混合液I 1000g离心
5、10 min，弃上清液沉淀I加0.30.5ml蔗糖液，混匀作涂片（细胞核）五、内容讨论1、密度梯度离心法的优缺点？优点：分离效果好，可一次获得较纯颗粒； 适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一 定浮力密度差的颗粒； 颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，防止已形成的区带由于对流而引起混合。 缺点：离心时间较长；需要制备惰性梯度介质溶液；操作严格，不易掌握。2、为什么选择肝细胞？肝脏细胞合成比较旺盛，能量代谢也比较旺盛。所以细胞核比较好提取，线粒体 也多一些。3、差速离心法的优缺点？优点:操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大 的角式转子。缺点
6、:分离效果差，不能一次得到纯颗粒;须经反复悬浮和离心加以纯化； 壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀； 颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。4、注意事项注意尽可能先充分剪碎肝组织,缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。最好在在04C或冰浴中进行将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防匀浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应用液不可使用。六、思考作业推测各张片子的染色结果，并写明你做出判断的原因。 ：用Giemsa染色为粉红色，少部分紫红色，形状有球形和颗粒状等，推测为 细胞匀浆，因为观测到许多深浅不一的染色物。 ：用Giemsa染色为粉红色，存在多种形状，无深紫色，推测为无细胞核的匀 浆，因为经低速离心后，细胞核应在沉淀中被分离开。 ：用Giemsa染色为紫红色，大量球形细胞器，推测为细胞核，因为在次低速 离心使细胞核纯度增加。 ：用健那绿一B染色为蓝绿色的散在粒状和短棒状的颗粒，推测为线粒体，因 为在高速离心下使较重的线粒体沉淀。 ：用健那绿一B染色为接近无色，推测为细胞质和一些较轻的物质，因为线粒 体被分离，而细胞质被还原为无色。
