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1、质粒载体介绍（质粒基本特性和种类及标记基因）、质粒的基本特性1 质粒的复制 通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起 始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和0复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于PMB1质 粒或ColEl质粒的复制起始位点。图3-1是其复制其始示意图。在复制时，首先合成前RNAII，即前引物，并与DNA形成杂交体；而后RNase H切割前RNAII ,使之成为成熟的RNAII ,并 形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。形成的RNA I可控制RNAII形成二级结构
2、，同时Rop增强RNA I的作用，从而 控制质粒的拷贝数。削弱RNAI和RNAII之间相互作用的突变，将增加带有pMBl或（ColEl）复制子的拷贝数。RNase H 腦沁 Jf 辱1*priRNAtRap图3-1带pMBl （或ColEl）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。2质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。表5-1就 是不同类的质粒与复制子及拷贝数的大致关系。表3-1:质粒载体及其拷贝数质粒复制子拷贝数PBR322及其衍生质粒pMB115 20pUC系列质粒及其衍生质粒突变的pMB
3、1500 700pACYC及其衍生质粒p15A10 212PSC101及其衍生质粒pSC1015ColElColEl15 20pUC系列质粒的复制单位来自质粒pMBl，但其拷贝数较高。pMBl质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提 供的半衰期较长的酶（DNA聚合酶I ,DNA聚合酶III）,依赖于DNA的RNA聚合酶，以及宿主基因dnaB、dnaC、dnaD和danZ的 产物。因此，存在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有pMBl （或ColEl）复制子的质粒将继 续复制，最后每个细胞中可积聚23千个质粒。3.质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中
4、不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时岀现的现象。不相 容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程 中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成 的一个群体，一般具有相同的复制子。在大肠杆菌中现己发现30多个不相容群，如ColEl和pMBl ， pSC101和p15A。4转移性质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因mob，转移基因tra， 顺
5、式因子bom及其内部的转移缺口位点nic。二、标记基因按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。选择标记用于鉴别目标DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑 选岀来，筛选标记可用于将特殊表型的重组子挑选岀来。抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。1 .氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr）氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽 聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转
6、肽反应并催化卜内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。青霉素是一类化合物的总称，其分子结构由侧链R-CO-和主核6-氨基 青霉烷酸（6-APA）两部分组成。在6-APA中有一个饱和的噻唑环（A）和一个卜内酰胺环，6-APA为由L-半脱氨酸和缬氨酸缩合 成的二肽。2. 四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene, tetr）四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白， 可阻止四环素进入细胞。pBR322质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。3. 氯霉素抗性基因（chlo
7、ramphenicol resistance gene, Cmr, cat）氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性P1噬菌体（也携带Tn9）。cat基因编 码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基23kDa）。在乙酰辅酶A存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙 酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。4. 卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编
8、码氨 基糖苷磷酸转移酶（APH （3） -II, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转 移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。5. 琥珀突变抑制基因supF在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为UAA），或琥珀突变（突变为UAG）， 或乳白突变（突变为UGA）。supF基因编码细菌的抑制性tRNA，可在UAG密码子上编译酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突变 的tetr基因和ampr基因，只有当宿主含有supF基因时才会对Amp和Tet具有抗性。相应的，s
9、upE基因在UAG密码子上编译谷 氨酰氨。由于目前所用的标记基因使用方便，因此用这类标记的载体较少。6其它还有一些正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。如蔗糖致死基因SacB， 来自淀粉水解芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens ），编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上sacB基因的表达对大肠杆菌来说是致 死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。（二）筛选标记筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段 的质粒，即重组质粒。1. a-互补（a-
10、complementation）a-互补是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 卜半乳糖苷酶邙-galactosidase，由1024个氨基 酸组成）阴性的突变体之间实现互补。a-互补是基于在两个不同的缺陷卜半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳 糖lac操纵子中的lacZ基因编码卜半乳糖苷酶，如果lacZ基因发生突变，则不能合成有活性的卜半乳糖苷酶。例如，lacZAM15基因 是缺失了编码卜半乳糖苷酶中第11-41个氨基酸的lacZ基因，无酶学活性。对于只编码N-端140个氨基酸的lacZ基因（称为lacZ）， 其产物也没有酶学活性。但这两个无酶
11、学活性的产物混合在一起时，可恢复卜半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。在lacZ编码区上游插入一小段DNA片段（如51个碱基对的多克隆位点），不影响卜半乳糖苷酶的功能内互补。但是，若在该DNA 小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无a-互补能力的卜半乳糖苷酶片段。利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插 入了外源片段的重组质粒。在相应的载体系统中，lacZAM15放在F质粒上，随宿主传代；lacZ放在载体上，作为筛选标记（图3-2）。相应的受体菌有JM系列、TG1和XL1-Blue，前二者均带有D （lac -proAB）FproAB + lacIq lacZD M15基因型。其中la
12、cI为lac阻 抑物的编码基因，laclq突变使阻抑物产量增加，防止lacZ基因渗漏表达。lacZ基因是乳糖lac操纵子中编码卜半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可诱导其表达。乳糖既是lac操纵子的诱导物，也是作用的底 物。异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作为lac操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物；5-溴-4-氯-3-吲哚-p-D-半乳糖苷（X-gal）可作为lac操纵子的底物，但不能作为诱导物。底物X-gal还可充作生色剂，被卜半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。通过插入失活进行筛选的质粒主要有pBR322，该质粒具有四环素抗性基因（tetr）
13、和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外 源DNA片段插入tetr基因后，导致tetr基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有 外源片段插入到载体中。、质粒载体的种类（一）克隆载体青霉素抗性基因（ampr），其质粒复制区来自pMBl （如图3-3）。目前使用广泛的多质粒载体几乎都是由此发展而来的。利用四环素 抗性基因内部的BamHl位点来插入外源DNA片段，可通过插入失活进行筛选。2. pUC18 和 pUC19pUC18和pUC19大小只有2686bp，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的DNA片段，GenBank注册号为L0
14、8752 （pUC18）和X02514 （pUC19）。由pBR322改造而来，其中lacZ （MSC） 来自M13mpl8/19图3-4是其质粒图谱。这两个质粒的结构几乎是完全一样 的，只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的rop基因，因此其拷贝数达500-700 pUC系列载体含有一段lacZ蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现a-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源 片段后，可通过a-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。ECOR I Ip4JC1BGAATTCGAGCTCGGTACGCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGC
15、AGCnGGC H-H_就I Kfn I殳麗| BamH I融删I I 屜 I PSi I Hine IIPUC1BPSI INsf IH銅II化超尸諭也1如XmallI IEtoR I1 Xba ISallBamH I*OClHlnc IINkSe I (1S3H湘II耦QfEcoO1D9I (防74)All HI (906)P0R332Sspl (2501Hae ll(W50r闻 wN I (1217)Xmn I imi)Seal (2177PBR322Crr1IOI(1l77g)Ml (217)PUC18/18CCCAAIjCTTGCATGCCTSCASeTCOACTCTAClAGGATCCCCtlGGTACCGAMTCiAATTC图3-4 :pUC18/19质粒图谱3. pUC118 和 pUC 119由pUC18/19增加了一些功能片段改造而来，大小为3162bp , GenBank注册号为U07649 (pUC118)和U07650 (pUC119)。相当 于在pUC18/19中增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。4. pGEM-3Z/4ZPGEM-3Z/4Z 由 pUC18/19 增加了一些功能片段改造而来，大小
