超声微泡可用于脑胶质瘤靶向药物递送

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1、超声微泡可用于脑胶质瘤靶向药物递送超声微泡可用于脑胶质瘤靶向药物递送 本文关键词：靶向，递送 超声，药物，可用于超声微泡可用于脑胶质瘤靶向药物递送本文简介：血脑屏障 (bloodbrainbarrier,BBB )对脑组织产生屏蔽积极作用，减小或消除 血液中有害物质(如毒素、病毒)对脑组织或许产生的损害，但同时 阻碍了脑组织处方药进入脑组织，给脑部疾病治疗带来语言障碍1. 如何通过药物载体或有的放矢药物递送技术将药物有效穿透BBB到达 靶区，成为药剂学研究和脑部疾病药物治疗的关注重点超声微泡可用于脑胶质瘤靶向药物递送本文内容：血脑屏障(blood brain barrier, BBB) 对脑组

2、织产生屏 蔽作用，减少或消除血液中有害物质(如毒素、病毒)对脑组织可 能诱发的损害，但同时阻碍了药物进入脑组织，给脑部疾病治疗带 来障碍1.通过药物载体或药物递送技术将药物如何有效穿透BBB到 达靶区， 成为手术药剂学研究和脑部疾病药物治疗的关注重点。最近 无创和有限开放 BBB 的研究受到关注，如低频聚焦超声联合微泡造 影剂可开放BBB2, 3,并且超声微泡已得到临床应用，其推断安全性 和有效性已被证实，如也已上市的微泡产品 Definity、Optison、 Image nt和全氟显。超声破碎微泡可产生空化效应。虽有研究证明低频聚焦超声 联合微泡可开放 BBB, 但要做到高水平、无创可逆、

3、靶向开放 BBB, 必须在大量实验基础上针对具体微泡和超声条件，探讨最适宜实验参 数， 包括超声频率、功率、辐照时长和微泡剂量。低频(1 MHz) 超声皮德盖可有效发挥微泡的空化效用4, 5,不仅能将大量微泡推 送至对侧管壁，而且很少对微泡产生聚集作用6, 7.本文通过固定超声频率、功率和微泡浓度药效，改变辐照时 长，确定无创可逆开放脑胶质瘤部位BBB的理想实验参数，并证明 超声微泡可用于脑胶质瘤靶向药物递送。材料与方法材料脂质微泡按照文献8处方和工艺，在超声 电学前制备。取大豆磷脂、吐温80、聚乙二醇1500 （4：10：100, w/w）混合，加入10倍量的二氯甲烷溶解，加热至65 C混匀

4、， 冷冻干燥 24 h, 得到脂质微泡冻干粉，充入全氟丙烷饱和，临用前 加入口服用水2 mL, 轻摇形成微泡混悬液。微泡大小均一，平均粒径 约3.26um,生理盐水稀释后的浓度为5.8X1086.7X108/mL，大鼠 给药剂量为3 mLkg?l.伊文思蓝 （Evans blue,EB, Sigma公司）； 4% 多聚甲醛（重庆市北碚漂白剂厂）。大鼠 C6 体细胞胶质瘤细胞 株购于中国科学院上海细胞库。荷瘤雄性 SD（Sprague-Dawley） 大 鼠，体重为280320 g,无特定病原体 （Specific pathogen Fr e e , S PF ）级，光谱分析温州医科大学实验动物

5、中心。仪器WDT-V型脑立体定向仪，小型颅钻，ST-III型三维手 动扎实推进仪（西安西北光电医疗器械厂）；Signa 3.0T磁共振成 像仪 （GE 公司） ；大鼠扫描专用线圈（上海晨光公司） ；低功率 聚焦超声治疗仪（温州医科大学附属第二疗养院）； UV300 分光光度 计（上海元析仪器股份有限公司）；BT01-100型恒流灌注泵（保定 兰格恒流泵管理有限公司）；BMJ-III型病理组织包埋机（常熟常州 中威电子仪器有限公司） ；旋转型石蜡切片机（英国珊顿公司） ； PHY-III病理组织漂烘仪（医疗保健常州中威医疗仪器有限公司）； 1X71倒置研究型显微镜（日本Olympus公司）；AC

6、AS ULTMA312型 电子束共聚焦显微镜（美国Meridian公司）。脑胆管癌模型的建立 调整C6细胞数为1X106/10 UL,用 台盼蓝排斥实验检测细胞活力&g t; 95% .腹腔注射1%戊巴比妥钠（3 mLkg?1）麻醉大鼠，剪去头顶部毛，在内毗连线与头部矢状尾端 底端交汇处，纵向头皮切口约1 cm长分离，暴露颅骨。将头部固 定在大鼠脑立体定位仪上，用碘酒、酒精顺序消毒，铺洞巾。选取大鼠右侧脑尾状核区为靶点，根据大鼠头部立体定向解 剖图， 确定对应于右脑尾状核的钻孔位置。用精神科钻钻直径约1 mm孑L,深达刺破硬脑膜表面但没有 刺破硬脑膜。用硫化氢注射器吸取10 UL细胞悬液，调节

7、定位仪上 的针尖使其触及硬脑膜,进针 6 mm, 后退1 mm, 使针尖西距硬脑膜 为5 mm,将细胞缓慢注入脑内，注射速度约为2.5 uLmin?1,注 完后留针约5 min,缓慢退针，用无菌骨蜡封路骨孔，缝合皮肤， 切口消毒。手术在无菌环境下让操作。对照组大鼠以等体积的培养液 替换细胞悬液。BBB开放性检测EB靶点染色EB静脉注射后可立即与血浆白 蛋白结合， 形成 EB 白蛋白复合物。复合物分子量大，不能透过完整 BBB; 但 BBB 开放性时复合物可渗透通过 BBB, 并且渗出量和 BBB 开 放水平呈正相关。因此可根据脊髓实质 EB 染色程度推测 BBB 开放程 度。大鼠超声辐照后立即

8、桐静脉注射 0.2% EB 溶液， 剂量为 2 mLkg?1, 4 h后打开左侧胸腔，生理盐水灌注，至右心房流出灌注 液变澄清，再用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）灌注至动物出现肌肉抽搐 后， 再缓慢灌注30 min, 然后处死大鼠，断头， 取端脑，用 4% 多聚甲醛溶液固定脑组织， 72 h 后切片。荧光显微镜观察脑组织冰冻切片，在显微镜下观察超声辐 照区及周围组织 EB 染色情况。脑中EB定量检测大鼠超声辐照后尾静脉注射0.2% EB溶液, 剂量为2 mLkg?1, 2 h后用生理盐水除去，取脑，称重。将局部 染色的脑组织按10 mLg?1帕鲁罗省浸入甲酰胺中，在60 C水浴 中放置 24 h

9、, 当甲酰胺溶液呈卵蓝色、脑组织呈无色透明状时，取 甲酰胺溶液测定620 nm处的EB吸收度。EB的分光光度法测定线性 范围为0.03910 ugmL?1.根据脑内EB浓度计算BBB的EB通透 率ug （EB） /g （脑组织）.磁共振常规及增强扫描磁共振 (magneticresonanceimaging, MRI)检查包括脑横断面及冠状面T1加权像(T1 weigh ted imaging, T1WI)、T2 力口权像(T2 weigh ted imaging, T2WI)及增强T1WI检查。增强检查是通过鼠尾阿司匹林0.4 mmolkg?l轧喷酸氯己定注射液(gadolinium-die

10、thylenetriaminepentaaceticacid, Gd-DTPA, 广州奥罗讷药业有 限公司)10 min后进行。扫描条件为T1WI TR 560 ms, TE 27 ms, 激励次数 (NEX) 2,矩阵 256X256; T2WI TR 2 300 ms, TE110 ms, NEX 2,矩阵256 X 256;扫描层厚2.4 mm,层间距2.9 mm,视野 (FOV) 56 mmX70 mm.超声参数设置 超声探头前端有循环水囊，设置水温25C。 将低频聚焦超声探头连接信号发生器，调节相应电压变量，再以连接 信号放大器。参数设定为：频率1.0 MHz、焦距5 cm、声强4

11、W/cm2和焦域2 mm.在大鼠颅顶均匀涂抹超声耦合剂，探头中心对准瘤体部位， 眼耳连线中点交界处，建立从超声探头到鼠头的连续性通路。超声时长的考察将筛检脑胶质瘤细胞 16天的荷瘤鼠随机分为对照组和超声微泡组。对照组(n = 5)经尾静脉注射生理盐水； 超声微泡组经尾静脉注射脂质微泡，剂量为3 mLkg?1,然后用超 声经颅辐照大鼠。分为超声微泡组按超声电磁辐射时间分为10 s组、 30 s 组和 60 s 组， 每组 10只。各组静注 EB 溶液，解剖后观察 仔细分析脑组织染色情况。同时通过苏木精？伊红 (hematoxylin-eosin, HE) 染色观察若无有无组织出 血坏死表现。接种

12、时间和超声时机接种的阻碍对施打脑胶质瘤细胞第 9、16、23和30天的荷瘤鼠分组：非超声静注EB组；超声微泡静注 EB组；先超声微泡后静注MR造影剂(Gd-DTPA)组；先静注MR造影剂组后超声微泡组。对各组进行解剖而后观察或 T1 加权相增强 扫描，测定各组胸部脑瘤部位及脑瘤边缘2 mm内的EB浓度。病理学观察填入脑组织冠状切片，用常规石蜡包埋， HE 染色，显微镜下观察有无组织出血坏死紫外光表现。统计分析 实验数据以均数土标准差（x 土 s）表示，两 两比较米用方差齐性检验、t检验。多组间非常数据比较米用方差分 析，方差分析中两组间均数比较采用SNK法检验。分析采用 SPSS13.0软件包

13、，以P < 0.05 （差异有统计学意义）表示。结果1超声时长对BBB开放的影响静脉注射 EB 后，察觉到对照组脑组织靶点（瘤体）表面 呈极淡蓝色（图1A），说明脑胆管癌可造成BBB微小开放。超声微 泡组与辐照区脑组织明显可见EB染色，随超声时间延长，染色程 度也增强，其中60 s组（图1D） > 30 s组（图1C）10 s组（图IB）。HE染色图中对照组、10 s组、30 s组显微镜下均 未见明显异常， 神经细胞包浆、核染色均匀， 核仁清晰， 核膜完整 血管结构尚完整，未见明显红细胞渗出，如30 s组，结果见图2A、 B;但60 s组见明显异常，有明显红细胞渗出（图2C、D），

14、即 长时间超声灼伤可显着造成局部脑组织损伤。因此，综合BBB开放 效果和民间组织损伤程度，确定超声时长为 30 s.对移植脑瘤细胞 30 天的荷瘤鼠静注 EB 后超声辐照，并进 行脑瘤组织切碎，激光共聚焦显微镜下发现对照组（注射EB）仅 见稠密点状红色荧光（图3A、B），而超声微泡组（30 s）辐照 二区可见大量红色荧光（图3C、D），证明超声微泡可促进EB渗透 穿过BBB进入脑胶质瘤非政府。2脑瘤生长期对BBB开放的影响脑胶质瘤细胞移植后的不同时期， BBB 通透性有较大差异。 单独静注 EB 染色，脑瘤部位染色效果很不明显；但超音波微泡操 作后，染色程度随脑瘤生长期延长普遍加强（图 4）。

15、在超声条件 下，静脉注射增强显影剂Gd-DTPA后，MR检查也呈现靶点BBB开 放（用MRI信号强度表示），具有脑瘤生长期依赖性。MRI 结果表明，先超声再给造影剂后 MRI 脑瘤显影效果明 显弱于先给造影剂再超声的情况（图4）， 说明超声在造影剂到达靶 部位展开表面时进行开放BBB效果最佳。超声时机和药物注射需实施 合适配合才能获得最强的BBB渗透。结果同时说明超声不会造成BBB 长期损伤，超声停止后，BBB迅速恢复。EB染色后在不同组织中浓度差异性中其可定量判断BBB渗透 性。在各时间点（9、16、23 和 30 天），超声微泡组脑瘤中 EB 一 直仍然维持较高浓度 （图 5）， 并且微泡

16、与超声微泡组瘤体狭长的 小鼠瘤体及瘤体边缘中EB浓度相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。超声微泡组瘤体边缘、对照组瘤体EB浓度一直保持 接近，说明超声微泡可或使BBB开放，促进EB进入脑瘤边缘；而脑 瘤本身也能造成BBB有限开放，但略高于开放程度远小于超声微泡效 应， 并且 EB 不大可能进入脑瘤边缘部位。讨论检测无创性BBB开放的方法包括EB染色法、透射电镜影像 学检查法和影像学检查（增强CT、增强MRI），最简便常用的是EB 染料法9.本文充分利用 EB 染色的特点，从外观、红色荧光、定量 定性分析检测方面系统考察了超声和脑胶质瘤对BBB开放的影响， 准确判断出脑瘤、超声微泡、脑瘤附近神经组织中所 EB 渗透情况和 BBB开放程度。Gd-DTPA是水溶性分子，不能通过BBB,但BBB开 放后可通过增强 MR 影像学，灵敏地显示 BBB 开放，并且可