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1、word高效液相色谱法1 简述 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进展别离侧定的色谱方法。注人的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被别离，并依次进人检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。1.1 对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪，由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监视局“液相色谱仪检定规程定期检定并符合有关规定。色谱柱内径一般为3.m，填充剂粒径为310m。超高效液相色谱仪是适应小粒径约2m填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度的高效液相色谱仪。色谱柱反相色谱柱：以键合非极
2、性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物符合硅胶和聚合物等；常见的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。手性别离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、外表积、键合基团的外表覆盖度、载体外表基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被
3、别离物质的性质来选择适宜的色谱柱。温度会影响别离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善别离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60。最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氛基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂;分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂;对映异构体的别离通常使用手性填充剂。 填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、外表积、键合基团的外表覆盖度、含
4、碳量和键合类型等)以与色谱柱的填充，直接影响供试品的保存行为和别离效果。孔径在15nm(lnm=10)以下的填料适于分析分子量小于2000。的化合物，分子量大于2000的化合物如此应选择孔径在30nm以上的填料。 除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在310m之间。粒径更小约2m的填充剂常用于填装微径柱内径约2mm)。使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配;如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40，为改善别离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜
5、超过60。流动相的pH值应控制在2-8之间.当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解;当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高外表覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机一无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等;当需使用pH值小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂，或有机一无机杂化填充剂等。1.1.2 检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、
6、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的量有关，还与化合物的结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定X围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与待测溶液的浓度通常呈指数关系，故进展计算时，一般需经对数转换。不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外-可见分光检测器，所用流动相应符合紫外一可见分光光度法(中国药典
7、2015年版四部通如此0401)项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发性盐组分的流动相。1.1.3 流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇一水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5%，否如此易导致柱效下降、色谱系统不稳定。正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。各品种项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类
8、型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、填充剂粒径、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。其中，调整流动相组分比例时， 当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变X围；当X大于33%时，允许改变X围为X-10%X+10%。假如需要用小粒径约2m填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也应作适当的调整。当对其结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足别离要求的品种，可在该品种正文项下注明。1.2 系统适用性
9、试验色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、别离度、灵敏度、重复性和拖尾因子等五个参数。按各品种项下要求对色谱系统进展适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进展试验，必要时，可对色谱系统进展适当调整，应符合要求。2.1.1 色谱柱的理论板数(n)用于评价色谱柱的效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测组分或内标物质的理论板数。 在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保存时间tR和峰宽(W)或半顶峰宽(Wh/2 )，按n=16(
10、tR/W)2或n=5.54 (tR/ Wh/2)2计算色谱柱的理论板数。tR、W、Wh/2可用时间或长度计下同，但应取一样单位。2.1.2 别离度(R)用于评价待侧组分与相邻共存物或难别离物质之间的别离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标.可以通过测定待测物质与杂质的别离度，也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分内标物质或其他难别离物质的别离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的别离度，对色谱系统进展评价与调整。无论是定性鉴别还是定量测定，均要求待测物质色谱峰与内标物质色谱峰或特定的杂质对照色谱峰与其他色谱峰与相邻色谱峰之间有较好的别离度。除另有规定外，待
11、测组分与相邻共存物之间的别离度应大于。别离度的计算公式为 R=2(tR2一tR1)/(W1+W2) 或R=2(tR2一tR1)/1.70 (W1.h/2+W2.h/2)式中，tR2为相邻两峰中后一峰的保存时间；tRl为相邻两峰中前一峰的保存时间；W1 、W2与W1.h/2 、W2.h/2 分别为此相邻两峰的峰宽与半顶峰宽。当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数(n)和别离度(R)均以峰宽(W)的计算结果为准。2.1.3 重复性用于评价连续进样后，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%；采用内
12、标法时，通常配制相当于80%. 100%和120%的对照品溶液，参加规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%。2.1.4 拖尾因子T用于评价色谱峰的对称性。拖尾因子计算公式为： T=W/2d1式中，W为5%峰高处的峰宽；d1为峰顶在5%峰高处横坐标平行线的投影点至峰前沿与此平行线交点的距离。以峰高作定量参数时，除另有规定外，峰高法定量时T应在0. 95之间。以峰面积作定量参数时，一般的峰拖尾或前伸不会影响峰面积积分，但严重拖尾会影响基线和色谱峰起止的判断和峰面积积分的准确性，此时应在各品种正文项下对拖尾因子作出规定。2.1.5
13、 灵敏度 用于评价色谱系统检测微量物质的能力，通常以信噪比(S/N)来表示。通过测定一系列不同浓度的供试品或对照品溶液来测定信噪比。定量测定作业指导书指导书编号 TYFDC-SOP-FF-028高效液相色谱法第5页 共10页第二版 批准李忠华初审吴雅凝起草郭欣时，信噪比应不小于10；定性测定时，信噪比应不小于3。系统适用性试验中可以设置灵敏度实验溶液来评价色谱系统的检测能力。1.3 测定法1.3.1 内标法按各品种项下的规定，精细称量取对照品和内标物质，分别配成溶液，精细量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量进样，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因
14、子 校正因子(f)=(As/cs)/(AR/cR) 式中As为内标物质的峰面积或峰高; AR为对照品的峰面积或峰高; cs为内标物质的浓度; cR为对照品的浓度。 再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，进样，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量 含量(cx)=f.Ax/(As/cs)式中，Ax为供试品峰面积或峰高；cx为供试品的浓度；As为内标物质的峰面积或峰高；cs为内标物质的浓度；f为内标法校正因子。采用内标法，可防止因样品前处理或进样体积误差对测定结果的影响。 1.3.2 外标法按各品种项下的规定，精细称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精细取
15、一定量，进样，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积或峰高)，按下式计算含量 含量(Cx)=CR(Ax/AR)式中各符号意义同上。由于微量注射器不易准确控制进样量，当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时，以手动进样器定量环或自动进样器进样为宜。1.3.3 加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精细称(量)取待测物对照品和参比物质对照品各适量，配作业指导书指导书编号 TYFDC-SOP-FF-028高效液相色谱法第6页 共10页第二版 批准李忠华初审吴雅凝起草郭欣制待测物校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按下式计算待测物的校正因子。校正因子(f)=(cA/AA)/(cB/AB) 式中cA为待测物的浓度；AA为待测物的峰面积或峰高;；cB为参比物质的浓度;；AB为参比物质的峰面积或峰高。也可精细称量取主成分对照品和杂质对照品各适量，分别配制成不
