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1、蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体一 实验目的掌握手工制作密度梯度的技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。二 实验原理2.1 概述密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点是：分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适应范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 此法的缺点是：离心时间较长；需要制备惰性梯度介质溶液；操作严格，不易掌握。 密度梯度区带离心法又可分为
2、两种： （1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。 离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降
3、系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1.28 kg/cm3和60。 此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间 （2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心从而形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。 离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。体系到达平衡状态后，再延长离心
4、时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。 等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。 等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝（CSCl），其密度可达1.7g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。2.2 梯度溶液的制备（1）梯度材料的选择原则。作为一种理想的梯度材料应具备以下几点：与被分离的生物
5、材料不发生反应即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。不会对离心设备发生腐蚀作用。容易纯化，价格便宜或容易回收。浓度便于测定，如具有折光率。对于超速离心分析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。这些条件是理想条件，完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。下面介绍几种基本上符合上述原则的梯度材料：糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。无机盐类：CsCl（氯化铯）、RbCl（氯化铷）、NaCl、KBr等。有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。硅溶胶：如Perc
6、oll。蛋白质：如牛血清白蛋白。重水。非水溶性有机物：如氟代碳等。（2）梯度材料的应用范围 蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。 聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。 氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐
7、类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。 卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。 Percoll：是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。2.3 密度梯度区带离心法图解图2-23 A速度沉降，B等密度沉降2.4 收集区带的方法（1）用注射器和
8、滴管由离心管上部吸出。（2）有针刺穿离心管底部滴出。（3）用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。（4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。三 实验材料新鲜菠菜叶。四 实验器材组织捣碎器，高速冷冻离心机，普通离心机，离心管，Corex离心管，烧杯，漏斗，纱布，载玻片，盖玻片。普通光学显微镜，剪刀，滴管，荧光显微镜。五 实验药品5.1 匀浆介质（0.25mol/L蔗糖、0.05mol/L Tris-Hcl缓冲液，pH7.4）配制方法： 称取85.55g 蔗糖，6.05g Tris，溶解在近400ml蒸馏水中，加入约4.25m
9、l 0.1mol/L的Hcl溶液，最后用蒸馏水定容至500ml。5.2 60% 蔗糖溶液，50蔗糖溶液，40% 蔗糖溶液，20%蔗糖溶液，15蔗糖溶液配制方法：配制80% 的蔗糖溶液，然后按照下表进行稀释，分别配制成50%，40%，20%，15% 的蔗糖溶液。六 实验步骤6.1 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取50g，剪碎。6.2 加入预冷到近0的匀浆介质100ml，在组织捣碎机上选高速档捣碎2min。6.3 捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。6.4 滤液移入普通玻璃离心管，在普通离心机上500r/min离心5min，轻轻吸取上清液。6.5 在Polyallomer离心管内依次加
10、入50蔗糖溶液和15 蔗糖溶液 (或依次加入60%，40%，20%，15% 的蔗糖溶液)，注意要用滴管吸取15 蔗糖溶液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50 蔗糖液面，一般两种溶液各加12ml （如果是四个梯度则每个梯度加6ml）。加液完成后，可见两种溶液界面处折光率稍不同，形成分层界面，这样密度梯度便制好了.6.6 在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁加入1ml上清夜。6.7 严格平衡离心管，份量不足的管内轻轻加入少量上清夜。6.8 用甩平转头离心18000r/min，90min。6.9 取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带，用滴管轻轻吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察。还可在暗室
11、内用荧光显微镜观察。七 结果与分析结果如图所示，叶绿体在由两种不同浓度的蔗糖溶液组成的混合液中，形成一条带，聚集在密度梯度交界处；而在由四种不同浓度的蔗糖溶液组成的混合液中，叶绿体可形成两条带，聚集在密度梯度交界处。沉降系数较大的细胞组份则沉到离心管底部。吸出叶绿体制成临时装片，暗室内用荧光显微镜观察，视野中可见到许多的小红点，这是由于叶绿体被荧光激发而产生的。结果证明，该方法可以较好的分离出叶绿体。八 离心操作的注意事项高速与超速离心机是生化试验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程
12、。8.1 使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。8.2 装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。8.3 若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。8.4 离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。8.5 每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。1
