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1、【实验目的】1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理2. 掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。【实验原理】 在生物化学、分子生物学和基因（遗传）工程实验中，常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。聚丙烯 酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白 质或核酸分离的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联 剂N, N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的 三维网状结构的凝胶。通过改变单体
2、浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于分离分子 量大小不同的物质。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵, 加速剂为N,N,N,N 四甲基乙二胺（简称TEMED）。通常控制这二种溶液的用量，使聚合在1小时内 完成。（2）光聚合：通常用核黄素为催化剂,通过控制光照时间、强度控制聚合时间,也可加入 TEMED 加速反应。聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶 （浓缩胶和分离胶）电泳。一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）； 凝 胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的
3、大小形状不同所致）。浓缩效应（浓缩胶与分离胶中 聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。因此，样品分离效果好，分辨率高。SDS即十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例 和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原 来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。与此同时，蛋白质在SDS作用下结构 变得松散，形状趋于一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异，仅仅取决 于蛋白质的分子量。另外，SDS-蛋白质复合物在强还原剂（巯基乙醇）存在下，
4、蛋白质分子内二硫 键被打开，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率 和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均 为常数。本实验采用化学聚合法制胶，进行不连续的凝胶电泳，并用考马斯亮蓝快速染色，以分离和鉴定大肠 杆菌菌体、发酵液中和纯化的蛋白产物。【试剂与器材】 （一）试剂（全班分两大组，每组配一份，如15组一份， 610组一份）（1）30%的凝胶贮备液：ACR 30g + Bis 0.8g溶于100 mL去离子水中，用3号新华滤纸过滤至棕 色瓶中，4C避光贮存（1）。（2）3mol/L Tri
5、s-buffer,pH8.9： Tris base 36.6 g + 1 mol/L HCl 48 mL + ddH2O 至 100 mL）（3）0.5mol/L Tris-HCl, pH6.8 :6.05g Tris base 溶于 40mL ddH2O 中，力口 1mol/L HCl 48mL,力口水补至100mL.（4）5XTris-甘氨酸电泳 buffer （pH8.3）:（配 1L）Tris-base 15.1g + 甘氨酸 94g + 5g SDS + H2O 至 1L （用时稀释 5 倍）。（5）10% SDS:：称10克SDS溶解于100mL去离子水中，贮存于室温中。（6）TE
6、MED （四甲基乙二胺）：浓度10%，20 mL （全班共用），4C保存。（7）10% AP （过硫酸铵）：10 mL，新鲜配制，分装至1.5mL离心管中，一20C保 存待用（2）。（8）样品溶解液：内含1% SDS, 1%巯基乙醇,40%蔗糖或20%甘油,0.02%溴酚蓝,0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL 缓冲液。*先配制0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液：称Tris 0.6g，加入50 ml重蒸水，再加入约3 ml 1mol/L HCL，调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100 ml*按下表配制样品溶解液：SDS號基乙醇漠酚蓝蔗糖0J)5mol/LT
7、ris-HCL加重蒸水至最后总体积为100 mg0mL2 mg2 mL10mL*如样品为液体,则应用浓一倍的样品溶解液,然后等体积混合。*或配制2 X SDS样品缓冲液：100mmol/L Tris-HCl （pH68）200mmolZLDTT4%SDS0.2%漠酚蓝20%甘油必要时加入少量（1%）巯基乙醇。（9）考马斯亮蓝染色液：0.05 g考马斯亮蓝R250溶于25 mL异丙醇里，加11 mL冰醋酸+H2O至 110 mL，用滤纸过滤除去不溶物。（10）0.1%溴酚蓝指示剂（全班共用）（11）脱色液：75 mL冰乙酸+ 50 mL甲醇+ 875 mL H2O （若只配500 mL，各物质减
8、半）（二）器材 电泳仪 垂直板电泳槽，电泳板微量进样器（50 UL）染色/脱色摇床。【操作方法】1. 胶板模型的安装：在干净的凹形玻璃板的三条边上放好塑料条（有些型号的电泳板已有固定的隔板） 然后将另一块玻璃板压上，用夹子夹紧（或装在制板模型中），在两块板之间滴上热融的 10 琼脂 糖凝胶封边（ 4）。2. 分离胶的制备10 ml，可供两块板（11cm x10 cm）使用用手轻摇混匀，小心将混合液注入准备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留足够的空间（2.5cm），轻轻在顶层加入几毫升去离子水覆盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制作用。刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝
9、胶已聚合。再静置 片刻使聚合完全，整个过程约需30分钟（25C室温）。3.浓缩胶的制备：先把已聚合好的分离凝胶上层的水吸去，再用滤纸吸干残留的水液。按下列配方制备各种体积的浓缩胶溶液：成分5mL8mL10mL15mL去离子水3.45.56虽10.230%凝胶液0.831.31.72.550,51-nol/L Tris-HCl(pH6+8)0-65LOL2510%SDS0.05(W(110J510% AP 心40SO100120TEF4ED心10121520混合后将其注入分离胶上端，插入梳子，小心避免气泡的出现。4. 在浓缩胶聚合的同时，将蛋白样品与2x样品缓冲液等体积混合，置沸水或微量恒温器（
10、100C ）中 加热3分钟，马上插入冰上冷却待用。5. 浓缩胶聚合完全后，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均加入 1X 电泳缓冲液，小心地拔出 梳子，用移液器冲洗梳孔，检查有无漏，并驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡。6. 按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，所加样品混合液体积要根据样品蛋白浓度 而定，一孔加一个样品，同时用已知分子量的标准蛋白作对照。本实验系统中需要分离鉴定的是纯化的GFP蛋白，点样样品和次序包括：蛋白MarkerpUC18细菌总蛋白pGFP未诱导总蛋白pGFP加Glu及IPTG诱导总蛋白pGFP加IPTG诱导破菌后上清总蛋白层析时的穿流峰（杂蛋白）层析时的洗涤峰
11、I层析时的洗涤峰IIGFP对照7. 电泳：开始时电压为58V/cm （约100V）凝胶，待染料浓缩成一条线开始进入分离胶后，将电压 增到1012V/cm （约180V）凝胶，继续电泳直到染料（溴酚蓝）抵达分离胶底部，断开电源。8. 剥胶：取下胶板，从底部一侧轻轻撬开玻璃板，用手术刀切去浓缩胶，并切去一小角作记号。9. 固定及染色：取下凝胶放入大培养皿，用考马斯蓝染色液染色并固定，最好放在摇床缓慢旋转 1-2 小时。10. 脱色：先用水洗去染料，再放入脱色液中浸泡，更换脱色液 3-4 次，约 4-8 小时或过夜。11. 将脱色后凝胶中的蛋白质分离色带照相或干燥，也可无限期地用塑料袋封闭在含 20
12、%甘油的水中。 【注意事项与提示】（1）丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺具有神经毒性，因此称量时要戴手套。两者聚合后即无毒性，但为避 免接触少量可能未聚合的单体，所以建议在配胶和制板过程中都要带上手套操作。另外，配好的溶液 之所以要避光保存，是因为此溶液见光极易脱氨基分解为丙烯酸和双丙烯酸。（2）过硫酸铵极易吸潮失效，因此要密闭干燥低温保存。配好的 10过硫酸铵要分装冷藏。（3）考马斯亮蓝R-250（三苯基甲烷）染色：每分子含有两个S03H基团，偏酸性，结合在蛋白质的 碱性基团上。与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色。检测灵敏度约为0.2 0.5ug。也可用银染色：将 蛋白带上的硝酸银还原成金属银、以使银
13、颗粒沉积在蛋白带上。此法比考马斯亮蓝灵敏两个数量级， 但步骤较复杂。（4）制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有 空隙，所以这步要特别留心操作。有些型号的电泳板可在模型中直接安装，免去了封边和拆边的麻烦， 还可以同时制备多块凝胶。（5）AP 和 TEMED 是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过快， 影响倒胶。为避免过快聚合，可将加了催化剂的凝胶先放在冰中。（6）加热使蛋白质充分变性。（7）用移液器冲洗梳孔可将空中的凝胶除去，以免点样孔不平齐或影响蛋白样品的沉降。（8）两玻璃板间凝胶底部的大气泡可阻断电流，因此必须除去。
14、（9）总量一般不超过20 ul,如果点样量太多溢出梳孔，就会污染旁边泳道。要根据样品浓度来加样 品溶解液。每点一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。（10）电泳时间要依据所用电压及待测蛋白分子量大小而定。（11）电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致，不能在凹形板双耳处撬，也不能用死力弄坏玻璃板。（12）考马斯亮蓝染色液盖过凝胶即可，染色后染色液要回收，可重复使用多次。（ 13）脱色过夜可使背景更干净，谱带更清晰。【实验安排】 本实验试剂配制和电泳可在一天内完成，各小组要在上午配好试剂并做好胶，中午或下午即可开始电 泳。【实验报告要求与思考题】 1就实验中出现的各种问题进行分析讨论。2. 在不连续体系SDS-PAGE中，当分离胶加完后，需在其上加一层水，为什么？3. 在不连续体系SDS-PAGE中，分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用。4根据下式计算标准蛋白和待测样品的电泳迁移率，然后以标准蛋白的相对迁移率为横坐标，其分 子量的对数为纵坐标作标准曲线图，根据标准曲线图准确计算待测蛋白的分子量。粗略估计待测蛋白 分子量的方法是直接根据凝胶上的分子量标准进行估算。5为什么样品电泳前要高温加热？ 6进行凝胶电泳时应如何选择样品点样，设置对照？
