《基因剂量及内质网分泌相关蛋白对α-半乳糖苷酶表达的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因剂量及内质网分泌相关蛋白对α-半乳糖苷酶表达的影响（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、基因剂量及内质网分泌相关蛋白对- 半乳糖苷酶表达的影响 - 半乳糖苷酶是一种能够催化水解各类以 键结合的非还原性末端 - 半乳糖苷化合物的外切糖苷水解酶。 本研究的主要目的是利用分子生物学技术和手段 , 构建并表达热稳定性好 , 酶活高的 - 半乳糖苷酶重组基因酵母工程菌。本研究将 Neosartorya fischeri P1- 半乳糖苷酶 Gal A 基因序列进行全基因人工合成 , 并连接到酵母表达载体pAO815上, 构建了 - 半乳糖苷酶重组表达质粒 pAO-Gal A, 随后成功将重组表达载体电转入毕赤酵母中进行表达。表达的 - 半乳糖苷酶 Gal A 的最适 pH 为 4.5, 最
2、适温度为 50 ; 单拷贝的 - 半乳糖苷酶 Gal A 平均酶活达到 55.74U/mL。终浓度 20 mmol/mL的 Fe Cl2 可以大幅提高 - 半乳糖苷酶的酶活。之后又成功构建了 - 半乳糖苷酶两拷贝和三拷贝重组表达质粒, 并转入酵母中进行了表达。两拷贝的 - 半乳糖苷酶重组表达菌株的- 半乳糖苷酶酶活达到95.22U/mL,比单拷贝菌株酶活提高70.83%; 而三拷贝重组表达菌株发酵液平均酶活为35.93 U/mL,比单拷贝菌株酶活降低35.54%。本研究还构建了4 种与内质网分泌蛋白相关基因与 - 半乳糖苷酶基因共表达的重组表达菌株, 结果显示 HAC1-GalA 共表达重组菌
3、株的平均酶活为64.24 U/mL,PDI-Gal A共表达重组菌株平均酶活 68.7 U/mL,Ero1-Gal A共表达重组菌株平均酶活70.71 U/mL, 分别比 - 半乳糖苷酶单拷贝重组表达菌株酶活提高15.25%、23.25%和 26.86%。Hsp40-Gal A 共表达重组菌株平均酶活30.67 U/mL,比- 半乳糖苷酶单拷贝重组表达菌株酶活降低了44.99%; 将两拷贝重组表达菌株小摇瓶发酵酶活最高的菌株进行 14 L 水平的发酵罐高密度发酵, 发酵 120 h 的上清液稀释 40 倍后 , - 半乳糖苷酶酶活达到 791.23 U/mL 。加入终浓度 20 mmol/mL 的FeCl2 到反应体系中时 , 酶活达到 1400U/mL。本研究的意义 : 通过利用分子生物学技术和手段构建并表达热稳定性好, 酶活高的 - 半乳糖苷酶重组基因酵母工程菌, 提高 - 半乳糖苷酶的表达量 , 降低生产成本 , 为 - 半乳糖苷酶的工业应用提供优良的候选酶。
