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1、苏州大学毕业设计（论文）学院(部)材料与化学化工学部题目类糖胺聚糖改性的纳米金表面对胚胎干细胞神经分化的影响目录第一章 前言31.1胚胎干细胞神经分化概述31.2类糖胺聚糖对胚胎干细胞神经分化的影响31.3金纳米粒子（AuNPs）的性能41.4 课题提出5第二章 实验部分62.1 试剂与仪器62.2金纳米粒子聚合物的制备82.2.1 MAG的制备82.2.2 MAG的RAFT聚合82.2.2.1 PMAG的胺解92.2.3 SS的RAFT聚合92.2.3.1 PSS的胺解102.2.4 AuNPs的制备102.2.5 类糖胺聚糖改性AuNPs的制备112.3聚合物及其改性AuNPs的表征112
2、.3.1核磁共振氢谱（1H-NMR）测试112.3.2气相凝胶渗透色谱（GPC）测试122.3.3动态光散射（DLS）测试122.3.4透射电镜（TEM）122.3.5紫外可见光测试（UV-visible）122.4细胞实验122.4.1细胞毒性测试122.4.1.1L929细胞复苏132.4.1.2L929细胞传代与计数132.4.1.3L929细胞种植142.4.1.4L929细胞毒性测试142.4.2胚胎干细胞（MECs）培养142.4.2.1 小鼠胚胎成纤维（MEF）细胞的复苏、传代与冻存152.4.2.2MEF饲养层细胞的准备152.4.2.3 MES细胞的复苏162.4.2.4小鼠
3、胚胎干细胞的分化培养162.4.2.5免疫荧光染色162.4.2.6聚合链式反应（PCR）17第三章 结果与讨论193.1单体以及聚合物的核磁图193.1.1 MAG的表征193.1.2 PMAG的表征203.1.3 PSS的表征203.2 PMAG与PSS的GPC测试213.3 PMAG-SH与PSS-SH的紫外可见光测试213.4金纳米粒子及其聚合物的性能表征223.4.1金纳米粒子的透射电镜（TEM）测试223.4.2金纳米粒子及其聚合物的动态光散射（DLS）测试233.4.3金纳米粒子及其聚合物的可见光测试243.5金纳米粒子及其聚合物的细胞毒性测试253.6金纳米粒子及其聚合物对胚胎
4、干细胞神经分化的检测263.6.1胚胎干细胞的免疫荧光染色263.6.2胚胎干细胞PCR测试27结论及展望28参考文献29致谢32摘要胚胎干细胞（ESCs）的多向分化潜能可以为神经系统疾病提供细胞替代治疗，即诱导ESCs向神经细胞方向分化，从而获得具有神经干细胞特性的细胞来代替坏死细胞。ESCs可以由特定生长因子或其他生物活性分子在体外诱导分化为特定的细胞类型，如：糖胺聚糖（GAG）作为一类生物活性分子可诱导ESCs定向分化为神经细胞。本论文基于糖胺聚糖促进神经分化的生物活性，采用苯乙烯磺酸钠（SS）（含磺酸基团）和N-甲基丙烯酰胺基葡萄糖（MAG）（含糖环）两种单体的可逆加成-断裂链转移（R
5、AFT）聚合方法来制备类糖胺聚糖聚合物，通过聚合物末端基团的胺解还原来获得巯基末端，并进一步将两种聚合物组装到金纳米粒子（AuNPs）表面，利用AuNPs与细胞的相互作用将类糖胺聚糖聚合物富集到细胞表面，从而提高类糖胺聚糖诱导ESCs神经分化的能力 。该策略以AuNPs作为类糖胺聚糖聚合物的富集载体，可以有效的调控磺酸基团和糖环两种结构单元在AuNPs表面的比例，从而系统的研究糖胺聚糖中糖单元与磺酸单元组成比例对其促进神经分化功能的影响规律。关键词：胚胎干细胞、神经分化、类糖胺聚糖、金纳米粒子AbstractEmbryonic stem cells (ESCs) of multi-direct
6、ional differentiation potential can provide cell replacement therapy for diseases of the nervous system, In this way, ESCs are induced to differentiate into nerve cells, thus obtaining cells with the characteristics of neural stem cells instead of necrotic cells.ESCs can by specific growth factors o
7、r other biologically active molecules in vitro differentiation for a particular cell types, such as: sugar glycosaminoglycans (GAG) as a kind of bioactive molecules can be induced directional differentiation of ESCs into nerve cells.In this paper, based on sugar glycosaminoglycans promote the biolog
8、ical activity of nerve differentiation, using sodium styrene sulfonate (SS) (containing sulfonic acid group) and N - methyl acrylamide glucose (MAG) (sugary loop) reversible addition of two kinds of monomer - breaking chain transfer (RAFT) polymerization method to the preparation of amine sugar chit
9、osan polymer, by amine solution of polymer end groups also original thiol end, and further to two kinds of polymer assembly to the surface of gold nanoparticles (AuNPs), using the interaction of AuNPs and cell amine sugar glycan enrichment of polymer to the cell surface,To improve class sugar glycos
10、aminoglycans induced ESCs neural differentiation ability.The strategy to AuNPs as class sugar enrichment of glycosaminoglycans of polymer carrier, can effectively control and sugar sulfonic acid groups two kinds of structural units in the proportion of the surface of AuNPs, thus system research of g
11、lycosaminoglycans in sugar sugar units with sulfonic acid composition on its promoting function of neural differentiation regularity.Keywords: Embryonic stem cells、Neuronal differentiation、Glycosaminoglycans、AuNPs第一章 前言1.1胚胎干细胞神经分化概述胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESCs）是从附置前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外抑制分化培养的一种全能性细胞系
12、，它既具有细胞系可扩增、遗传和冻存的特点；又类似胚胎细胞，具有发育的全能型。近些年来，中枢神经退行性疾病（例如：帕金森病、阿尔兹海默氏病和脊髓损伤等）严重危害了人类的健康，而胚胎干细胞的多向分化潜能可以为这些疾病提供细胞替代治疗，即诱导ESCs向神经细胞方向分化，从而获得具有神经干细胞特性的细胞来代替坏死细胞。一般来说，诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞有很多种方法，由于胚胎干细胞可以由特定生长因子或其他生物活性分子在体外诱导分化为特定的细胞活组织1-3，所以我们可以在培养基中加入生长因子（例如：神经生长因子（NGF）、表皮生长因子（EGF）以及成纤维细胞生长因子（FGF）来促进ESCs进行神经分
13、化4-6，但是这些生长因子的成本比较高，存放也比较困难，因此极大的限制了它们的应用。近年来，研究者们发现糖胺聚糖（GAG）具有促进ESCs进行神经分化的功能7，GAG是存在于体细胞中的活性大分子，即一类有特定重复二糖结构单元的线性多糖分子，其重复的二糖结构单元通常为一个氨糖（D-氨基葡萄糖或氨基半乳糖）与一个糖醛酸（葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸）残基组成，由于单糖不同程度的硫酸酯化结构，使重复单元具有结构多样性，因此GAG在结构上具有复杂性和异构性。硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）是一种常见的GAG，它已经被证明可以促进神经细胞的分化22-26，但后续研究中，当HS无法正常硫酸酯
14、化时，ESCs的神经分化受到了抑制25，因此证明硫酸酯化对干细胞分化有着重要的作用。与此同时，另外还有研究证明，特定的糖环骨架结构，如葡萄糖胺结构，对干细胞的分化也有不可缺少的作用20。因此我们将运用具有磺化单元和特定糖环的生物活性大分子来诱导ESc的神经分化。1.2类糖胺聚糖对胚胎干细胞神经分化的影响类糖胺聚糖是一种模拟GAG的化学结构并且具有与其相似生物功能的生物大分子。我们已知GAG对ESc的神经分化有很好的诱导作用，但是GAG是哺乳动物分泌的天然大分子，它有其固有的缺点，如：结构异质性、杂质以及其不受控制的多糖骨架和磺酸结构8，所以研究者们合成了一些具有GAG生物活性的GAG类似物8-
15、10，这样既克服了GAG的固有缺点，又保留了它的生物活性。因此类糖胺聚糖对研究ESc的神经分化是至关重要的物质。近年来，陈红课题组基于糖单元（N-甲基丙烯酰胺基葡萄糖，MAG）和磺酸单元（苯乙烯磺酸钠，SS）的共聚构建了一种类糖胺聚糖聚合物结构，通过调节共聚物中糖单元和磺酸单元的比例获得了优于天然糖胺聚糖的促进神经分化的效果11-12，由此可见，类糖胺聚糖中的糖单元和磺酸单元的组成比例对其促进神经分化的功能至关重要。1.3金纳米粒子（AuNPs）的性能金纳米粒子是最早出现、研究最为深入的纳米材料之一，其独特的理化性质使其受到了越来越广泛的关注。目前各种金纳米粒的合成方法已经非常成熟，而对其应用性的研究则成为热点。由于金纳米粒子制备简便，而且具有良好的生物相容性，除此之外，它的粒径可控且稳定性好。因此金纳米粒子广泛应用于医学检测分析、生物传感以及疾病诊断和治疗等生物学领域13-15。金纳米粒子最为经典的应用便是其在生物检测中的应用，例如基于金纳米粒子的检测试纸条是发展非常迅速的一种快速检测蛋白质和核酸的方法16-17。而金纳米粒子修饰的电化学传感界面为DNA的识别与电化学信号的传输提供了更好的方案，为未来基因诊断的发展提供了新的机遇18。除此之外，金纳米粒子由于其
