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1、荷花花粉多糖提取工艺条件的优化任务一苯酚-硫酸法测疋荷花花粉多糖含量方法的研究一、原理苯酚-硫酸试剂可与多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应。多糖在浓硫酸的作 用下水解成单糖并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚缩合成橙黄色有色化合物， 以葡萄糖为标准品，然后用紫外分光光度计在约490nm处（己糖）测定光吸收值 与糖浓度的线性关系，进而对样品定量，所得的测定结果是以葡萄糖含量计多糖 含量。二、试剂浓硫酸：分析纯，95.5%。80%苯酚：80%苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20%水使之溶解，可置冰箱中避 光长期贮存。5%苯酚：临用前以80%苯酚配制。标准葡聚糖（Dextran，瑞典Pharmacia），或分析纯
2、葡萄糖。荷花花粉精制多糖溶液的配制：精密称取荷花花粉精制多糖，配成不同浓 度的溶液。三、荷花花粉多糖的提取1、工艺流程荷花花粉f破壁f粉碎f过筛（40目）f脱脂f浸提f过滤f取上清液测定2、浸提条件：浸提温度：50C，浸提时间：3h,料液比：1：8，浸提次数：2次四、实验条件的选择（一）最大吸收波长的选择吸取2 mL的荷花花粉多糖溶液，置于15 mL比色管中，加5%苯酚液1. 0 mL， 迅速滴加浓硫酸5. 0 mL，振动均匀后放置5 min，然后放入沸水浴中加热15 min， 迅速冷却至室温。另加蒸馏水2 mL，按同样显色操作为空白。用752p-紫外分光 光度计在波长440500范围内测定，
3、确定其最大吸收峰对应的波长。最大吸收波长的确定0.800 0.600 -0.400-0.200 -0. 000 11440. 0460. 0480. 0500. 0破长/nm（二）显色条件的选择1、显色温度分别吸取2 mL的花粉多糖样品溶液，嚣于15 mL具塞试管中，加5%苯酚1.0 mL。摇匀，迅速加入浓硫酸5. 0 mL,摇匀放置5 min,分别于室温，40C, 60C, 80C和100C下显色20min，测吸光度。显色温度0.800 0.600 -0.400-0.200 -0. 000 L0 20406080 100 1202、显色时间吸取一定量样品，分别进行不同时间（10 min， 2
4、0 min， 30 min， 40 min, 50 min， 60 min）的显色反应后，测其吸光度。显色时间0.800 0.600 -0.400-0.200 -0. 000 1102040时间/min60803、显色剂用量在其它条件不变（取以上得到的最佳显色条件）的情况下，只改变苯酚浓度 （3%，4%，5%，6%，7%，8%），各测其吸光度，得到吸光度一显色剂浓度 曲线。显色剂用量0. 8000.6000. 4000.2000. 00010显色剂用量期五、测定方法1、制作标准曲线准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分 别吸取 0.4ml，0.6ml， 0.
5、8ml， 1.0ml， 1.2ml， 1.4ml， 1.6ml 及 1.8ml，各以水 补至2.0ml，然后加入5%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，静止10分钟，摇匀，室 温放置20分钟后于最大吸收波长（490nm左右）处测光密度，以2.0ml水按同 样显色操作为空白，以横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。2、样品含量测定吸取样品液1.0ml（相当于40ug左右的多糖），加入5%苯酚1.0ml及浓硫酸 5.0ml，静止10分钟，摇匀，室温放置20分钟后于最大吸收波长（490nm左右） 处测光密度，以标准曲线计算多糖含量。图表标题多糖含量/mg亠吸光度任务二浸提工艺条件花粉多糖提
6、取工艺条件的优化一、花粉多糖提取工艺流程（一）工艺流程荷花花粉f破壁f粉碎f过筛（40目）f脱脂f浸提f过滤f浓缩f醇沉f静 置f抽滤（除去乙醇，取沉淀）f除蛋白f醇沉f过滤f丙酮（或乙醚）洗涤f 干燥f粗多糖（二）操作步骤1、破壁：酶法破壁2、脱脂：用石油醚回流2h，过滤。滤渣自然晾干，用95%乙醇回流2次，每次 2h，过滤，滤渣自然晾干。（云南产红花蜂花粉多糖的分离提取及含量测定）3、浸提：加一定量的水在一定温度下浸提一定的时间4、过滤：抽滤或离心，保留上清液5、浓缩：旋转蒸发浓缩或真空浓缩，至原体积的1/46、醇沉：加4倍95%乙醇（或无水乙醇）沉淀多糖7、静置：在4C下静置24h8、抽
7、滤：除去乙醇，取沉淀9、除蛋白：沉淀用Sevag法去除蛋白。向一定体积的多糖液中加入20%该体积 的氯仿，5 %该体积的正丁醇，振荡20 min后，离心，取上清液。至280nm无明 显吸收峰。10、醇沉：再加4倍95%乙醇（或无水乙醇）沉淀多糖11、过滤：抽滤或离心，取沉淀12、洗涤：丙酮（或乙醚）13、干燥：真空干燥或冷冻干燥参考文献：1、荷花蜂花粉多糖提取条件的研究2、蒲黄花粉多糖提取工艺研究3、云南产红花蜂花粉多糖的分离提取及含量测定（三）花粉多糖含量测定：苯酚-硫酸法（四）花粉多糖提取率的计算花粉水溶性多糖含量油菜花粉含量xlOO%二、花粉多糖提取最佳工艺条件的研究（一）单因素实验影响
8、水提荷花花粉多糖提取率的主要因素为提取温度、提取时间、提取次数 及料液比，水平选择见表1。通过单因素试验确定它们作用的合适范围，可以为 荷花花粉水提多糖正交试验提供数据和参考。1、料液比对多糖提取率的影响称取5份荷花蜂花粉各1g,每份花粉样品按不同料液比（1： 4、1： 6、1： 8、 1： 10、1： 12）加水，在50C水浴中浸提3 h,离心，沉淀重复提取1次，收集 上清液，定容至100 ml，取样液1 ml，按多糖含量测定方法测定多糖。计算含 量，画图。从中可以得出料液比对多糖浓度的影响。见图1。多糖浓度（ug/ml）2OTI2 一I 1O 一I 一I2、提取温度对多糖提取率的影响分别称
9、取6份荷花蜂花粉样品各1 g按图一中的最佳料水比加入蒸馏水，然 后分别在30、40、50、60、70、80摄氏度下水浴浸提3 h,冷却、过滤、收集 滤液。按多糖含量测定方法测定多糖。计算含量。从中可以得出温度对多糖提取的影响，见图2。424038363432多糖浓度(Wml)20406080100120溟度(T)3、提取次数对多糖提取率的影响分别称取6份蜂花粉样品各l g,按料液比1： 8加入蒸馏水，然后在50C下水浴浸提3 h.分别进行6次抽提试验，比较提取液多糖浓度，结果见图3。OOOOOOOO7 6 5 4 3 2 1多糖浓度(ug/ml)提取枚数对提取率的影响12345674、提取时间
10、对多糖浓度的影响分别称取份蜂花粉样品5份各l g,按料液比1： 8加入蒸馏水，然后在50C下水浴浸提，并做平行.提取时问分别为I、2、3、4和5h,冷却、过滤、收集 滤液。按多糖含量测定方法测定多糖.计算含量。从中可以得出提取时间对多糖 浓度的影响，见图4。OOOOOOOO 7 6 5 4 3 2 1I 54图I 4握取时间（二）正交试验设计根据L9（34）正交试验设计表进行正交试验。在单因素试验基础上设计4因素 3水平正交试验，对荷花蜂花粉多糖的提取条件进行优选。选择条件是：料液比、 提取温度、提取时间、提取次数。采用正交表2进行正交试验，以多糖含量为考 察指标，筛选最佳提取条件。称取荷花蜂
11、花粉粗粉5.0g。分别装在27个磨口三角瓶中，按表3正交试验 设计方案浸提、抽滤。滤液用去离子水定容至250 ml；分别吸取2 ml上述定容 的溶液于100 ml容量瓶中进行稀释，定容至刻度：分别取稀释后的样液1.0ml 于25 ml试管中，按照配制标准曲线的方法处理样品，在490 nm处测定其吸光 度。计算多糖含量。正交试验因素水平是在单因素试验结果上选取了最佳的水平，如表2所示。表2正交实验因素水平水平A料液比B提取温度（C）C提取时间（h）D提取次数11:6502121:8603231:107043表3正交试验结果分析L9 （34）编号ABCD多糖浓度 ug/ml平均值 ug/ml111
12、112122231333421235223162312731328321393321任务三酶法破壁工艺条件对花粉多糖提取率的影响1、果胶酶添加量对提取率的影响条件:荷花花粉乳浓度30 %, pH自然，温度45 C,处理时间10h ,纤维素酶用量30u/g花粉，果胶酶用量分别为50、100、150、200、300 和 400u/g （花粉）.结果见图一果胶酶用量对提取率的影响10080 -i 60 -髯4。-20 -0 111110100200300400500酶用量u/吕 翩）2、纤维素酶添加量对提取率的影响条件:果胶酶300 u/g （花粉），纤维素酶添加量分别为，30、60、90、120 和150 u/g花粉其余条件不变，结果如图二10080 60髯40200C纤维素酶用量对提取率的影响111150100150200纤维吕翩)3、酶解时间的选择条件:荷花花粉乳浓度30%,果胶酶300u/g花粉，纤维素酶120u/g （花粉）,pH 自然，温度45 C,时间分别为2h , 4h , 6h , 8h , 10h 结果见图三10080 廉60 髯40200C酶解时间对提取率的影响III51015时间(h)
