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1、1. 目的为规范技术人员NK细胞操作,特制订本管理制度。2. 范围本规程适用于科贝细胞治疗。本规程适用于NK细胞制备的实验过程。3. 职责实验室技术人员负责本规程的实施。4. 工作程序4.1. 抽取病人外周血60ml(红盖管1管,绿盖管6管)。4.2. 将红盖管里的血转入50ml离心管里,离心2000r,20min(湘仪台式低速离心机L-550,离心机升降速度均调为2),取上层血清,并加入3P-A-L(3P-A-L浓度10)。4.3. 将绿盖管中的血加入到悬浮液中(血:悬浮液=10:1),轻轻混匀。4.4. 将细胞分离液加入50ml离心管中,将4.4中的血沿着管壁缓慢加入分离液中(血:分离液=
2、2:1)。4.5. 将4.4中的血放入离心机中离心2000r,20min,离心结束后将白膜层取出,放于一个新的50ml离心管中。4.6. 向取出的白膜层中加入细胞洗液10ml,用吸管吹打数次,吹打匀后,放入离心机离心1500r,8min(离心机升降速度可调为8),离心结束,弃上清。依照上述步骤,加入6ml洗液,1500r,5min再洗一次。4.7. 用PBS将包被好的培养瓶洗涤两次备用。4.8. 向离心好的细胞中加入细胞接种液,用电动助吸器吹打数次,吹打匀后,转入准备好的培养瓶里(血:接种液=2:1)。再将4.2中处理过的血清加入培养瓶中(血清浓度10)。4.9. 将培养瓶置于37,5二氧化碳
3、培养箱培养。4.10. 当细胞生长到第三天时,向培养瓶中加入NKB1和NKB2各1ml。4.11. 配制培养基:每1000ml培养基中加入2-3ml修正液和2支白介素-2。4.12. 当细胞生长到第四天时,向培养瓶中加入100ml4.11中处理好的培养基。4.13. 以后每天观察,根据细胞悬液颜色添加培养基,每次按瓶中已有培养基等比例添加。若一个培养瓶中培养物的量达到max线,则采取分瓶处理。4.14. 当细胞生长到约第9-11天时,根据细胞的生长情况,转移到培养袋培养(气泡尽量排空,以免影响细胞生长)。4.15. 以后每天观察,根据细胞悬液颜色添加培养基,每次按袋中已有培养基等比例添加。4.16. 约培养至第十五或十六天,进行计数,当细胞达到所需剂量时,即可离心收细胞待用,同时对细胞进行质量鉴定。4.17. 将完成好的细胞悬液封好,核对病人姓名、性别、年龄、医院和质量鉴定结果等信息无误后,贴上标签,填好相应表格并签名后,送回进行回输。5. 记录表格: NK细胞治疗操作流程记录表