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1、免疫组化一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白 的表达情况二实验原理:应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通 过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞 内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或 免疫细胞化学技术.三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显 色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等四实验设备：切片机、4C冰箱、显微镜、烤片
2、机五主要试剂配置:缓冲液应用液ANaH2P0438.4g配成1000毫升溶液应用液BNa2HPO412H20114.8g配成1000毫升溶液配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加& 5gNaCl。枸橼酸钠抗原修复液应用液A枸橼酸10.55g配成1000毫升溶液应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）29.01g配成1000毫升溶液配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升，碘酸钠 0.2g，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解 后将其
3、混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。抗体说明书建议的抗体稀释度N-Ras1:50-1:500H-Ras1:50-1:500K-Ras1:20-1:200六实验步骤：1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72C烤箱烤片2小时。2 切片脱蜡水化程序 二甲苯I、II脱蜡各12分钟；无水乙醇I、II各3分钟；（洗二甲苯）95%乙醇3分钟；85%乙醇3分钟；3 自来水漂洗 3 分钟，洗涤一定要充分。4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入pH6.0, 0.01M抗原修复液约1000ml，切片插入 塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀） 1600W 预热至沸腾，扣上压力阀 130
4、0W,待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。5 停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂3%H2O2, 室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。7取出切片，擦干组织周围液体后滴加10%BSA封闭液，37C孵育40分钟。滴加一抗（浓 度配比,PBS稀释1:20、1:50、1:100、1:200） 60ul，注意保持组织湿润状态但表面不能有 液体，用试管使抗体全部覆盖组织面且不能有气泡，以使抗体能全部与组织接触。8滴加一抗后放入专用孵育盒内，4C冰箱过夜。9切片放入PBS缓冲液中清洗3
5、分钟X3次，充分洗涤，防止因洗涤不净引起的非特异性染 色。（前两次的PBS倒掉）10擦干组织周围液体后滴加70微升辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物（根据实际情况要求 覆盖样本），37C温箱内孵育40分钟。PBS缓冲液洗涤3分钟X3次.11显色，滴加现配适量DAB显色剂（在1ml试剂2 （DAB底物液）中，加入1滴（约50ul） 试剂1 （DAB浓缩液），混合液，即配成DAB工作液），配置DAB显色剂的容器在冰冻切片 机旁边的冰箱里，其它试剂在入门口冰箱。室温显色,5-20分钟。自来水终止显色。第一 遍的自来水需集中处理，自来水洗涤3分钟。12复染，苏木素染液中染色40秒，水洗1分钟。131%盐酸酒精溶液分化 3 秒，流水漂洗。14蓝化10秒，流水漂洗。15脱水，切片依次置于85%乙醇，95%乙醇各1分钟，无水乙醇1、11中各2分钟。16透明，切片依次置于二甲苯1、11中各2分钟17中性树胶封片。
