基因治疗综述

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1、基因工程综述基因治疗研究进展及基因载体介绍摘要：基因治疗是一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾 病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。癌症基因治疗是基因治疗的主 要应用领域。基因治疗的基本组成元件是：载体(病毒载体、非病毒载体)、转导 基因(外源基因)和靶基因。本文主要综述基因治疗的载体研究进展和基因治疗的 疾病研究进展、存在的问题和发展前景。关键词：基因治疗 病毒载体 非病毒载体 发展前景基因治疗(gene therapy, GT)最早指在原位用正常基因替换缺陷基因来治疗人 类疾病，后来指将外源基因导入细胞以纠正基因缺陷，其概念随分子遗传学技术 的不断发展而拓展，目前

2、指将外源基因转移至患者细胞内并有效地适度表达，以 达到治疗疾病的目的。基因治疗可以是直接修复、补偿缺陷基因。或抑制某些基 因的过度表达；也可间接增强机体免疫功能。或利用外源基因对病变细胞特异性 杀伤等。1一、基因治疗中载体研究进展基因治疗这项生物医学技术要求将目的基因运输到靶细胞，进而将目的基因 运输到细胞核部位。因此，基因治疗的关键技术是基因传递载体的设计。基因治 疗中常用的载体有病毒载体和非病毒载体，病毒载体主要包括慢病毒载体、逆转 录病毒载体、腺病毒载体等；非病毒载体主要是纳米载体和高分子载体。1、病毒载体1.1 腺病毒载体腺病毒载体是目前临床基因治疗中使用最多的载体，占所有使用的基因治

3、疗 载体 24。腺病毒载体在基因治疗中的优点有：首先，给人方便。可以多种途 径给入，如肌注、静注、口服和雾化吸人。其次，安全性好。经临床及实验研究 证实，常用的5 型腺病毒无致病及致癌作用，不会引起癌基因激活。再次，宿主 范围广。动物实验表明，给予机体腺病毒后，可分别在肝脏、肺脏、心肌及骨髓 肌发现感染并可表达所载的目的基因，另外局部注射如肌肉、大脑及视网膜后等 部位，也可使之感染并表达。2然而，它缺乏特异靶向性，在一些缺乏其相应受体的细胞中感染效率低。现 在很多实验室在构建靶向腺病毒载体，它们主要针对腺病毒天然噬性进行改造， 从而只对特异性受体具有靶向性2。在体内应用时产生的免疫反应也限制了

4、它的 应用，空壳载体删除了病毒基因组，只保留了 ITRs 及包装信号，也称为裸腺病 毒载体，是第3代腺病毒载体。它去除了所有病毒编码基因，仅保留了5 7 和3 末端反向重复序列与野生型腺病毒的包装信号。需要辅助病毒提供编码序列。空 壳载体可以容纳多达36 kb的外源DNA,可以携带大量CDNA与适宜的调控元件， 比起第1 代和第 2 代载体，空壳载体表现出低免疫原性和体内表达的持久性。 因此,以第三代腺病毒为载体在进行基因治疗中具有重要意义。3 1.2 逆转录载体反转录病毒(Retrovirus)是一类已知的RNA病毒。该载体系统有两部分组成， 一是带有外源基因的重组反转录病毒载体分子。二是能

5、以反式提供病毒结构蛋白 的包装细胞，其要求是能高效产生感染靶细胞的霞组病毒颗粒。且无野生型的反 转录病毒存在，后者是基因治疗安全性的关键问题。逆转录病毒载体最大优点是：(1) 转染谱广，可以感染各种细胞类型；(2)转入的外源基因可完全整合；(3)对细 胞感染率高，达到100；(4)感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达 外源基因。根据报道利用逆转录病毒作为载体来进行血友病 A 的基因治疗已经有 了很大的进展。4其中，Y逆转录病毒载体(一般由小鼠白血病病毒MLV改造而来)是最早被改 造的且最广泛地被应用到基因治疗当中。1990年，Blaese等用Y逆转录病毒载 体来表达腺苷脱氨酶(aden

6、osine deaminase，ADA)基因，该载体被命名为LASN， 用于治疗两例重症联合免疫缺陷(ADA severe combined immunodeficiency，ADA SCID)的儿童患者。但存在着一些不足：不能感染非分裂细胞；转录终止能力 相对较弱；从有可能造成转录通读；可能产生有复制能力的病毒；可能造成插入 性突变；包装外源基因的能力有限(一般在7 kb以下)等。慢病毒是属于逆转录病毒的成员之一，它的特点是可以感染分裂期和静止期 细胞。而且与其他载体相比慢病毒载体的免疫原性比较低。同样，它也可以整 合基因至宿主细胞中使其长期稳定表达。因此，慢病毒在基因治疗中具有良好的 应用

7、前。1.3 其他病毒载体除上述常用的病毒载体外，应用于基因治疗的载体还包括腺相关病毒，单纯 疱疹病毒，痘病毒和溶瘤病毒。其中腺相关病毒最常用于眼部疾病的基因治疗， 如遗传性视网膜退行性病变。腺相关病毒(AAV)载体作为基因转移载体具有安全 性好、宿主范围广、转染和表达效率高、目的基因长期表达等优势，是视网膜色 素变性基因治疗领域最具潜力和应用价值的病毒载体6。2、非病毒载体非病毒载体具有成本低、制备简单、便于大规模生产、安全性高、外源基因 长度不受限制等优点。最简单的非病毒基因转移系统是裸DNA，可直接注入特定 的组织，特别是肌肉，造成较高水平的基因表达。目前，正在研究的非病毒载体 还有聚合物

8、(聚-L 一赖氨酸、聚乙烯亚胺等)、复合载体以及纳米粒子载体等。 2.1 纳米生物技术基因治疗载体2.1.1 纳米基因载体的优点纳米基因载体的优点： (1)纳米脂质体主要由群脂以及胆围醇合成，这两种 化学物质本身就是细胞膜的主要成分，由于它们仿生物膜的特点，可以通过与细 胞膜的融合或者胞吞作用将目的基因导人靶细胞； (2)纳米微生物材料具有生物 兼容性和可生物降解性，在传递过程中无毒，无免疫原性，并且可以通过新陈代 谢降解，因此不会对细胞产生毒性； (3)通过调节纳米材料的降解速度，还可以 控制目的基因的释放速度，延长其治疗效果； (4)纳米基因载体比表面积大，并 可在表面偶联靶细胞的配体或抗

9、体，实现基因治疗的主动靶向性，大大提高基因 传递的特异性和加强靶细胞对目的基囡的摄取。 72.1.2 纳米基因载体类型纳米基因载体主要有一下几类：(1)纳米脂质体，是由脂质体构建的囊泡/囊膜载体，根据载体自身所带 电荷分为阳离子脂质体、中性脂质体和阴离子脂质体。阳离子脂质体是非病毒载 体中研究和应用最多的载体之一。 8(2) 微胶粒，一种薪兴的纳米载体，由双亲性的共聚物在水溶液中自动聚 合而成，亲油端形成核，亲水端形成外壳。作为基因载体，阳离子的亲水集团可 将核酸分子浓缩吸附在微胶粒的表面。多聚阳离子形成的微胶粒外壳在内吞溶酶 体内可干扰溶酶体膜的完整性，逃避溶酶体的降解。(3) 纳米粒载体，

10、是由高分子材料合成的一种固态胶体纳米级颗粒载体。 这些高分子材料通常具有良好的生物兼容性，可生物降解，对机体基本无毒害， 无免疫原性。常用的合成材料有PLA、PLGA、壳聚糖、聚氰基丙烯酸乙酯等， 可制备成带正电荷的纳米粒吸附核酸或经物理包埋将核酸浓缩包裹在纳米粒。纳 米粒有利于被组织细胞摄取，主要经胞吞作用进入细胞，通过高分子材料的降解 逐渐释放出核酸。壳聚糖是一种从虾皮、蟹壳等提取出来的天然高分子氨基多糖，分子量一般 为几万至几十万不等。 Mumper 等最早报道了壳聚糖与质粒溶液混合自组装成纳 米微粒。纳米微粒大小、稳定性以及转染效果与壳聚糖的分子量、壳聚糖中氨基 (N)与DNA磷酸基(

11、P)比例(N/P)、DNA浓度、pH值、离子强度以及温度等有关。 Yoo 等研究发现，用 PEG 修饰壳聚糖后其转染效率在体内、体外实验中均有所提 高。Zuo等研究发现，通过共转染壳聚糖酶基因，促进入胞的壳聚糖/DNA复合 体解聚，可提高转染效率。【9壳聚糖纳米粒作为一种新型的基因递送系统，以 其具备无毒性、生物可降解性和良好的生物相容性、药物缓释和药物靶惫传递， 以及其本身带正电荷易与DNA、RNA结合等特性成为良好的基因载体。聚乙烯亚胺，是最早用于组织培养和体内试验的阳离子聚合物，在目前基因 转染中应用最多，也是高分子基因载体中最突出的一例9。聚合物间的孔隙可包 装外源基因或抗癌药物，作为

12、导入载体应用于基因治疗10。 )PEI 是目前设计得最 成功的聚合物。主要有线状和分枝状两种结构。PEI每3个原子中有1个为胶基 原子，可在生理条件下发生质子化，使PEI具有高正电荷密度，并且PEI在较宽 pH 范围内都具有很强的缓冲能力。由于其自身的内吞缓冲特性，在不需要吞噬 泡或溶酶体溶解剂的情况下显示出更好的基因转染效果PEI的“质子海绵假说” (proton sponge hypothesis)作用，引起溶酶体肿胀破裂，使PEI / DNA复合物得以 放入胞质。此外，PEI的结构屈衄性、PEl分子质量及其N/P (聚合物中氮的量与 DNA中磷酸酯的量之比)对DNA转移都有重要作用。PE

13、I带有大量正电荷，导致 了较大的毒性，成为限制其体内应用的重要因素之一。 11二、基因治疗的研究进展1968 年首次提出了基因疗法的概念；1990年美国成功基因治疗了一位因ADA基因缺陷导致严重免疫缺损的4岁女孩，成为首个基因治疗临床试验世界各 国都掀起了基因治疗的研究热潮【12； 2004年，首个治疗产品重组人p53抗癌注 射液面世，截至2004年6月底，全世界范围内基因治疗的临床试验方案已有 987 个。全球基因治疗走向产业化发展。现在各种病毒载体和非病毒载体的研究正在火热的进行中，并在不同的疾 病上已经有一定的理论成效，在大量的实验的检测中，又对存在的问题进行不断 的分析，对载体不断的进

14、行改进，使得载体能够越来越具体，越来越能够在基因 治疗中发挥优势，而缺点则不断的消失。三、基因治疗中存在的问题1、安全性和有效性目前，基因治疗领域存在的主要问题是有效性和安全性，主要表现为：（1） 基因导入系统缺乏靶向性，效率也较低。（2）目前针对遗传性疾病的基因治疗方 案大多采用逆转录病毒载体，其插入或整合到染色体的位置是随机的，有引起插 入突变及细胞恶性转化的潜在危险13。例如病毒感染的细胞，通常不只一种，这 样，当病毒载体携带基因进入人体，它们改变的不仅是靶细胞。而且，当基因被 加入DNA中时，也存在新基因加错地方的可能，因而导致癌症或其它损害的危 险（3）理想的基因治疗应能根据病变的性

15、质和严重程度不同调控治疗基因在适当 的组织器官内和以适当的水平或方式表达。但目前还达不到这一目标，其主要原 因是：现有的基因导入载体容量有限，不能包容全基因或完整的调控顺序，同时 人们对导入的基因在内的转录调控机理的认识有限13。 2、社会与伦理当体细胞基因治疗在细胞培养和动物模型中进行了较多的试验研究后，就基 因治疗是否很快就试用于病人而言，生命伦理学家讨论的首要问题在于体细胞基 因治疗预期或潜在的利弊。14美国费城18 岁的格辛戈患了一种遗传性疾病 良性鸟氨酸基转移酶（OTC）缺陷症。这种鸟氨酸代谢失调的疾病本可以通过营养 和药物得以控制，但他却接受了宾夕法尼亚大学人类基因治疗研究所给予的

16、基因 治疗临床I期试验，他也是该研究所的第18位和最后一位受试者。在试验中， 由威尔森（James Wils on）领导的研究小组将包含外源性治疗基因的腺病毒载体颗 粒（最大剂量）注人到他的肝脏内。第二天，格辛戈病情加重，血氨急剧攀升，夜 间开始昏迷不醒。 4天后，由于强烈的免疫排斥反应，格辛戈因多个器官衰竭而 死亡。这是第一例直接因体细胞基因治疗而死亡的临床试验。因此对于基因治疗的临床试验中，伦理问题不可避免的出现在当中。如应对 伦理问题，重要的是以下几点：（1）首先是，重视基因治疗技术的安全性15。在 对人进行实验前 ，要充分的进行动物试验，并且完善病人的评估报告。了解病 人的具体的身体状况，如是否过敏，各器官的生理状况等。（2）充分保障病人的 知情权。在进行实验前，要让病人充分了解到本次试验所存在的危险。临床医师 在为病人作出诊断和治疗方案后，必须向