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1、多糖含量测定的几种不同方法比较 淮北煤炭师范学院信息学院 2012级学士学位论文 多糖含量测定的几种不同方法比较 系 别: 信 息 学 院 专 业: 生 物 工 程 学 号:20081853021 姓 名: 姜 玉 龙 指 导 教 师: 查 岭 生 指导教师职称: 讲 师 2012年 5 月 10 日多糖含量测定的几种不同方法比较姜玉龙淮北师范大学信息学院 生物系指导老师: ?岭生摘要:本文综述了多糖含量测定的几种常用方法,主要有苯酚-硫酸法、3, 5-二硝基水杨酸法简称DNS法、蒽酮-硫酸法、色谱法、红外光谱定量分析多糖法等。并对这些方法的优缺点进行了分析和比较。这些方法可为多糖含量测定提供
2、一定的参考,并为多糖含量测定的更深入研究提供一定的理论基础。关键词:多糖;含量;测定;方法 A review of different methods to the determination of polysaccharides JIANG YulongDepartment of Biology, School of Information, Huaibei Normal UniversityTutored by ZHA LingshengAbstract: Paper reviewed some different methods to the determination of polys
3、accharides, in it phenol-vitriol method, 3, 5-two nitro salicylic acid DNS method, anthrone-vitriol method, chromatography, infrared spectrum quantitative analysis and etc had been dealed with. And the advantages and disadvantages of these methods are analyzed and compared. It provided some related
4、information and based theories to the determination of polysaccharides content.Key words:polysaccharides; content; determination; methods 目 录中文摘要I英文摘要II1前言12化学法测定多糖含量12.1苯酚-硫酸法12.2 3, 5-二硝基水杨酸法简称DNS法22.3蒽酮-硫酸法23色谱法测定多糖含量的研究33.1气相色谱法GC33.2 液相色谱法HPLC33.3薄层色谱法TLC44其他方法44.1红外光谱定量分析多糖法44.2生物传感器法55结论56展望6
5、参考文献6致谢91前言 多糖polysaccharides,PS是由10个以上的单糖聚合而成的生物高分子1。多糖包含均多糖homosaccharide和杂多糖heterosaccharide。前者是由同一种单糖组成,后者则是由两种以上不同的单糖组成。多糖除含有单糖外,还含有糖醛酸、氨基糖、糖醇、脱氧糖等基团。多糖按来源可分为动物多糖、植物多糖、微生物多糖和藻类多糖;按酸碱性可分为酸性多糖、中性多糖及碱性多糖;按溶解性可分水溶性多糖、水不溶性多糖、酸性多糖和碱性多糖等2。多糖的研究是现代药学研究的热点之一,多糖具有多种功效,经研究表明其在免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗溃疡、降低胆固醇、降血压以及抗血
6、栓等多方面具有良好的药理活性。在多糖工业生产过程中,常需对多糖的含量进行测量和监控,由于多糖的种类繁多,多糖含量和存在形式也多变。因此,选择适当的多糖分析方法十分重要。传统的多糖含量测定方法为苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法,但这两种方法测定步骤繁琐,而且只能测定样品中总糖的含量,若样品中含有单糖,则会使测定结果偏高;再者硫酸具有严重的腐蚀性,苯酚极易氧化,给实验操作带来极大不便。3, 5-二硝基水杨酸法简称DNS法具有操作简便、快速、灵敏度高、杂质干扰较小等优点,近年来逐渐被应用于植物药、中成药、海洋生物药等药物中多糖含量的测定3-5。本文综述了多糖测定的几种常用方法,并对其优缺点进行了比较。这些
7、方法可为多糖含量测定提供一定的参考,并为多糖的更深入研究提供部分理论基础。 2化学法测定多糖含量2.1苯酚-硫酸法 在多糖的定量分析中,苯酚-浓硫酸法是被广泛应用的方法之一6。其原理是多糖在浓硫酸作用下水解成单糖并迅速脱水生成糠醛衍生物,与苯酚缩合成有色化合物,以葡萄糖为标准品,然后用紫外分光光度计在约490nm处测定光吸收值与糖浓度的线性关系,进而对样品定量,所得的测定结果是以葡萄糖含量计的多糖含量。该方法具有操作简单、快速、重复性好,显色后稳定性较好等优点,但对有色样品结果易偏高。 苯酚-硫酸比色法主要用于甲基化的糖、戊糖、寡糖类以及多聚糖的测定。甚至可以用于糖肽和糖蛋白的测定7-8。此法
8、优势在于可以进行大量样品的测定,实验时基本不受蛋白质存在的影响,且产生的有色化合物在120min内颜色稳定。从目前各种文献资料来看,苯酚硫酸法测定的最大吸收波长多在480-491nm范围内,而实际应用时会因为水解出单糖种类的不同而出现偏差,如螺旋藻多糖中含有鼠李糖、半乳糖、甘露糖、核糖等成分,最大吸收波长在480nm处;茯苓多糖水解后得木糖、核糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖,最大吸收波长于490nm处9。杨春等指出苯酚暴露于空气中或在日光下被氧化逐渐变成粉红色,故应进行沙浴回流,用棕色瓶子收集馏出液。得到纯净苯酚。实验用苯酚溶液未加硫酸为现配溶液,并且每次用苯酚浓度一致,否则将会影响实验
9、结果。苯酚液配制时,需按比例加入一定量的铝片和碳酸氢钠蒸馏,所得馏分再加蒸馏水配得10。2.2 3, 5-二硝基水杨酸法简称DNS法 3, 5-二硝基水杨酸法简称DNS法是一种新的多糖含量测定的方法,此法已被用于植物药、中成药、海洋生物药等药物中多糖成分的含量测定11。DNS法测多糖含量具有操作简便、快速、灵敏度高杂质干扰较小等优点。DNS法测定原理为3, 5-二硝基水杨酸与多糖水解产物还原糖共热后生成棕红色的氨基化合物 3-氨基-5-硝基水杨酸,在一定的范围内,还原糖的含量和反应液颜色成比例关系,利用比色法可测定多糖的含量。DNS比色法中,色素等还原性物质可与DNS显色剂显色,采用水解前测定
10、值校正水解后测定值的方法,简便、有效地排除了色素等杂质的干扰12-15。DNS试剂即3, 5-二硝基水杨酸试剂,可采用直接配制的方法,也可先配制甲液和乙液,再将两液混合。配制显色剂过程中加入结晶酚可增加试剂的显色作用,亚硫酸钠可进一步增强试剂的稳定性。在选择测定波长时要考虑多方面的因素,既要考虑是否为最大吸收波长,又要考虑在该波长下测定结果是否稳定。样品测试液的制备过程中,酸水解时间不能太短也不能太长,时间短则多糖水解不完全,时间长则单糖和盐酸发生化学反应生成糖醛,不能和3, 5-二硝基水杨酸发生缩合反应。因此,水解时间要严格控制,否则会影响测定结果的准确性。该方法为半微量定糖法,简便、快速、
11、适用于大量样品的测定。改良的DNS方法可使己糖和戊糖的混合糖样的分析结果更准确16。 此外,尹银嘉等采用DNS法测二味康口服液中多糖的含量,二味康口服液具有益气扶正,补脾益肾等功效,主要成分为黄芪和刺五加17。制剂工艺主要保留了多糖成分。用该法测定多糖含量可以克服用苯酚-硫酸法测定过程中硫酸带来的腐蚀性,因此安全可靠。2.3蒽酮-硫酸法 蒽酮-硫酸法是多糖类在浓硫酸作用下水解、脱水,再与蒽酮结合成有色化合物,于最大吸收波长处测吸光度18-20。蒽酮-硫酸法稳定性较差,宜新鲜配制并注意避光。此外,色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定的干扰。 蒽酮-硫酸法测多糖含量,特点是几乎可以测定所有的碳水
12、化合物,不但可以测定戊糖与己糖,而且可以测所有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下,用蒽酮法可以一次测出总量,省去许多麻烦,因此,有特殊的应用价值。同时,苯酚有毒性,为致癌物质,且对某些多糖可能诱导发生副反应,致使测得结果不准,使用蒽酮则避开了此点不足。此外,不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同,果糖显色最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖较浅,五碳糖显色更浅,故测定糖的混合物时,常因不同糖类的比例不同造成误差。蒽酮-硫酸法测定时的最大吸收波长差异范围较大,一般葡萄糖在580nm处有最大吸收峰,而从目前文献来看,植物多糖最大吸收波长多在562-630nm范
13、围内21。在测定过程中,待测液需在冰水浴中缓慢滴加蒽酮-硫酸液,经过一定时间,在沸水浴中反应后,冰浴降温后测量。另外,蒽酮-硫酸溶液的加入量要与供试品溶液成一定比例才有较好的显色效果,加热时间要足够。 3色谱法测定多糖含量的研究3.1气相色谱法GC 气相色谱法可定性、定量分析多糖的组分和含量。一般是将多糖酸水解或甲醇醇解,用衍生物法以增加其挥发性。在GC研究中,糖有两类衍生物,一类是三甲基硅醚衍生物,是通过糖在吡啶或二甲基亚砜等非水溶剂中与六甲基二硅烷,三甲基氯硅烷,双三甲基硅烷基乙酰胺,三氟甲磺酸三甲基硅酯等反应形成,这类衍生物容易制取并具有较强挥发性。另一类糖衍生物是醋酸衍生物,包括三氟醋
14、酸盐多羟基醇衍生物,三氟醋酸多羟基醇衍生物,醋酸乙醛肟衍生物,醋酸腈衍生物等。气相色谱分析法常用的色谱柱有填充柱和毛细管色谱柱22-24。近年来,随着多程序升温技术的完善,石英毛细管柱应用更为普遍,在糖分析中主要采用AT-1701、DB-1701、HP-1701、OV-1701、OV-17、OV- 225、SE-30、SE-33、SE-52、DB-1 等。被分离产物的检测常采用灵敏度高、选择性好的检测器,最常用的氢火焰离子化检测器hydrogen flameionization detector,FID,具有最高的选择性和灵敏度。此外也用到火焰光度检测器 flame photomericdet
15、ector,FPD、电子捕获检测器electron capturdetector,ECD、质谱检测器MS等。3.2 液相色谱法HPLC 糖的高效液相色谱分析方法已成为常规分析方法。可对单糖和寡糖进行常量和微量分析。高效液相色谱分析糖类化合物色谱柱一般采用氨基键合固定相,可用于分离一般的单糖、寡糖等。常用的氨基键合色谱柱有碳水化合物柱、Amino- sil-X-1、Lic hroe orb-NH2、Hypersil NH2、Polygosil 60-5NH2、YMG-NH2、Amide-80、ZORBAX 氨基柱等。乙腈和水通常可作为流动相,糖的保留时间随水的比例减少而减少。C18和C8硅烷色谱柱也常用于糖分析。此外,阳离子交换柱也可用于糖分析,一般是以聚苯乙烯型阳交换色谱树脂制作,有H+型、Ca 2+、Ag+、Pb2+等离子型。一般以水作流动相,在较高温度7
