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1、PCR 实验常见失败原因、对策分析及体系优化PCR 虽然为一个简单的实验，但在实际过程中可能会出现各种问题。产生问题的原因可能 来源于以下几个方面：实验操作，试剂质量， PCR 反应过程中各种试剂的含量，以及反应 条件，温度设置等，本文对各个方面进行了讨论，大家遇到问题后可以对号入座的查一下。 当然，具体问题的解决还依靠实验者就可能的原因逐项排除，并不断的摸索才能彻底解决。假阴性，不出现扩增条带PCR 反应的关键环节有模板核酸的制备， 引物的质量与特异性， 酶的质量及， PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质， 模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没
2、有消 化 除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活： 需更换新酶， 或新旧两种酶同时使用， 以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导 致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。
3、引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳， 一定要有引物条带出现， 而且两 引物带的亮度应大体一致， 如一条引物有条带， 一条引物无条带， 此时做 PCR 有可能失败， 应和引物合成单位协商解决。 如一条引物亮度高， 一条亮度低， 在稀释引物时要平衡其浓度。 引物应高浓度小量分装保存， 防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分， 导致引物变质降解失 效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变
4、：通常进行 PCR扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或100ul，应用 多 大体积进行 PCR 扩增， 是根据科研和临床检测不同目的而设定， 在做小体积如 20ul 后， 再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性 ;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物 与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水 溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是 PCR 失败的原因之一。靶序列变异： 如靶序列发生突变或缺失， 影响引物与模板特
5、异性结合， 或因靶序列某 段 缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需 重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染： 这种污染有两种原因： 一是整个基因组或大片段的交叉 污染， 导致假阳性。 这种假阳性可用以下方法解决： 操作时应小心轻柔， 防止将靶序列吸入 加样枪内或溅出离心管外。 除酶及不能耐高温的物质外， 所有试剂或器材均应高压消毒。
6、所 用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 必要时，在加标本前， 反应管和试剂用紫外线照射， 以破坏存在的核酸。 二是空气中的小片段核酸污染， 这些小片段比靶序列短， 但有一定的同 源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致， 或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与 非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物 聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易
7、出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93 C变性，65 C左右退火与延伸）。出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差， dNTP 浓度过高， Mg2+ 浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减 少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低 Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。克隆 PCR 产物1）克隆 PCR 产物的最优条件是什么？最佳插
8、入片段：载体比需实验确定。1： 1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1： 8或 8：1 也行。 应测定比值范围。 连接用 5ul 2X 连接液 , 50ng 质粒 DNA,1Weiss 单位的 T4 连 接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4C过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载 体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4C过夜。2）PCR 产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带， 不需要用凝胶纯化。 如可见其他杂带， 可能是积累了大量 引物的二聚体。 少量的引物二聚体的摩尔数也很高， 这会产生高比例的带有引物二聚体的克 隆，而非目
9、的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。3）如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A ）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用 SOC稀释到1000ul后,用 100ul 铺板。培养过夜，产生 1000 个菌落。转化率为： 产生菌落的总数 /铺板 DNA 的总 量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板
10、，共用1 ng DNA。转化率为：1000 克隆 X10 （3 次方） ng/铺板 1 ng DNA ug=1O （6 次方）cfu/ ug转化 pGEM-T 应用 10（8 次方） cfu/ ug 感受态细胞 如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生20-40蓝斑（用指定步骤10 （8次方）cfu/ ug感受态细胞） ，表明载体失去 T 。可能是连接酶污染了核酸酶。 T4 DNA 连接酶（ M1801 ， M1804， M 1 794 ）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA 连接酶替换。D）用pGEM-T或pGEM-T Ea
11、sy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生20-40 蓝斑 , 没有菌落或少有菌落，连接有问题。4）对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？A ）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4C过夜。B） 插入片段带有污染， 使3-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T 正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3-T缺失。C） 插
12、入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接， DNA 必需重新纯化。D） 带有修复功能的耐热 DNA聚合酶的扩增产物末端无 A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy 载体克隆所需。加 Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加 A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy 载体技术资料（ TM042 ）。E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生 缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如 SURE 细胞PCR 反应体系与反应条件标准的 PCR 反应体系：10 X扩增缓冲液4种dNTP混合
13、物引物模板 DNATaq DNA 聚合酶Mg2+加双或三蒸水至10ul各 200umol/L各 10100pmol/L0.1 2ug2.5u1.5mmol/L100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、 酶、dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互 补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链 做引物，利用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则： 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 引物扩增跨度：以 200-500bp 为
14、宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 引物碱基： G+C 含量以 40-60%为宜， G+C 太少扩增效果不佳， G+C 过多易出现非特异条 带。 ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补， 特别是 3端的互补， 否则会形成引物 二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物 3 端的碱基， 特别是最末及倒数第二个碱基， 应严格要求配对， 以避免因末端碱基不 配对而导致 PCR 失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数
15、据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1lumol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高 会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然 酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为 100ul 时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系， dNTP 粉呈颗 粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其 PH调节到7.07.5,小量分装，-20C冰冻保存。 多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L ,尤其是注意4种dNTP 的浓度要相等 （ 等摩尔配制 ），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低 ），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。模板 （靶基因 ）核酸 模板核酸的量与纯
