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1、间接 ELISA 检测方法的建立 用方阵法确定抗原最佳工作浓度，阴、阳性血清最佳稀释度，酶标二抗最佳稀释度需要的试剂与器材：纯化的病毒液 阳性(小鼠第三次免疫时的血清)和阴性血清(未免疫的阴性小鼠血清) 0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液，PH=9.6 0.5% BSA封闭液 PBST(PH=7.4,0.01mol/LPBS, 0.05%Tween-20)洗液 HRP标记的羊抗鼠IgG(HRP-IgG) 12mol/LH2SO4终止液 底物显色液邻苯二胺(OPD、稀释液为柠檬酸缓冲液) 96 孔 酶 联 板，酶标仪用四个96孔板做实验,加入的羊抗鼠HRP-IgG稀释度分别为12000,1:40
2、00,1:8000,1:16000.1=1:1600阴性 血清2=1:8 00阴 性血清3=1:4 00阴 性血 清4=1:2 00阴 性血 清5=1:1 00阴 性血清1=1:1600阳性 血清2=1:8 00阳 性血清3=1:4 00阳 性血清4=1:2 00阳 性血清5=1:1 00阳 性血清1112=100u1PBSTA=50ug/m1 病毒 抗原B=40ug/m1 病毒 抗原C=30ug/m1 病毒 抗原D=20ug/m1 病毒 抗原E=10ug/m1 病毒 抗原F=5ug/m1病毒抗原GH1. 用0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液,PH=9.6,将病毒稀释成50卩g/mL、40卩g
3、/mL、30卩g/mL、 20卩g/mL、10卩g/mL、5卩g/mL 6个浓度梯度，分别包被96孔酶联板AF行，100卩1/ 孔，4 C 放置过夜，次日，用 洗液 PBST(PH=7.4,0.01mo1/LPBS, 0.05%Tween-20) 洗板3次，每孔加入100卩1 0.5% BSA封闭液，37C封闭1 h，PBST洗板3次；2. 分别加入阳性和阴性血清，阳性血清和阴性血清分别做 1:100、 1:200、 1:400、 1:800 和 1:1600倍比稀释，37C孵育1 h,弃一抗，PBST洗板3次；3. 每孔 加 入 100卩1 1:2000/1:4000/1:8000/1:16
4、000稀释的 HRP标记的 羊抗鼠IgG（HRP-IgG）, 37C孵育1 h,弃二抗,PBST洗板3次后，每孔加入50卩1底物显色液邻 苯二胺（OPD、稀释液为柠檬酸缓冲液），37 C避光显色15 min后，每孔加入 50卩12mo1/LH2SO4进行终止。（如果显色效果不理想，可以考虑分别用10,15,20min显色）4随后在酶标仪上读取OD490值，选择阴性血清孔（N）的OD值0.2、阳性血清孔（P）的 值1.0、P/N2.1的抗原抗体最大稀释度为最佳工作浓度。（所有的OD值先减去PBST孔的 OD 值进行调零）二对三次免疫后的小鼠血清效价进行检测，选取效价较高者加强免疫需要的试剂与器材
5、： 纯化的病毒液 阴性血清（未免疫的阴性小鼠血清） 0.05mo1/L 的碳酸盐缓冲溶液， PH=9.6 0.5% BSA封闭液 PBST（PH=7.4,0.01mo1/LPBS, 0.05%Tween-20）洗液 HRP标记的羊抗鼠IgG（HRP-IgG） 12mo1/LH2SO4终止液 底物显色液邻苯二胺（OPD、稀释液为柠檬酸缓冲液） 96孔酶联板，酶标仪血清稀释度（1： X）血清号 1000 2000 4000 8000 16000 32000 640001234567阴性1. 纯化抗原用包被液稀释至已确定的最佳工作浓度2. 以lOOul/孔量加入酶标板孔中，置4C过夜或37C吸附2小
6、时。3. 弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干4每孔加200ul封闭液4C过夜或37C封闭2小时5洗涤液洗3次；此时包被板可-20C或4C保存备用6.每孔加适量免疫小鼠血清（倍比稀释），同时设立阴性对照（阴性对照血清为已确定的最佳稀释度）； 37C 孵育1-2小时；洗涤，拍干6加酶标第二抗体，每孔100ul,稀释度为已确定的最佳稀释度，37C孵育1-2小时，洗涤，拍干7加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液lOOul，37C30分钟8.以2mol/L H2SO4终止反应9在酶联免疫阅读仪上读取OD值三间接ELISA筛选杂交瘤细胞阳性克隆株杂交瘤细胞在融合后2 周左右即可筛选，
7、即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称 为抗体检测。融合10d换液后，待杂交瘤细胞生长至培养孔1/10或者培养上清变黄时，吸取待检孔上清lOOuL 加入检测板孔中.需要的试剂与器材： 纯化的病毒液 阳性（小鼠第三次免疫时的血清）和阴性血清（未免疫的阴性小鼠血 清） 0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液，PH=9.6 0.5% BSA封闭液 PBST（PH=7.4,0.01mol/LPBS, 0.05%Tween-20）洗液 HRP标记的羊抗鼠IgG（HRP-IgG） l2mol/LH2SO4终止液 底物显色液邻苯二胺（OPD、稀释液为柠檬酸缓冲液） 96 孔 酶 联 板，酶标仪1
8、23456789101112Aa+b1+ca+b2+ca+b3+ca+b4+ca+b5+ca+b6+ca+b7+ca+b8+ca+b9+ca+d+ca+e+ca+f+cBa+b10+ca+b11+ca+b12+ca+b13+ca+b14+ca+b15+ca+b16+ca+b17+ca+b18+ca+d+ca+e+ca+f+cCa+b19+ca+b20+ca+b21+ca+b22+ca+b23+ca+b24+ca+b25+ca+b26+ca+b27+ca+d+ca+e+ca+f+cDa+b28+ca+b29+ca+b30+ca+b1+ca+b31+ca+b32+ca+b33+ca+b34+ca+
9、b35+ca+d+ca+e+ca+f+cEa+b36+ca+b37+ca+b38+ca+b39+ca+b40+ca+b41+ca+b42+ca+b43+ca+b44+ca+d+ca+e+ca+f+cFa+b45+ca+b46+ca+b47+ca+b48+ca+b49+ca+b50+ca+b51+ca+b52+ca+b53+ca+d+ca+e+ca+f+cGa+b54+ca+b55+ca+b56+ca+b57+ca+b58+ca+b59+ca+b60+ca+b61+ca+b62+ca+d+ca+e+ca+f+cHa+b63+ca+b64+ca+b65+ca+b66+ca+b67+ca+b68+a
10、+b69+a+b70+ca+b1+ca+d+ca+e+ca+f+ccca=最佳工作浓度的纯化抗原；b=100ul杂交瘤细胞培养液上清；c-最佳稀释度酶标二抗；d=PBST空 白对照；e-最佳稀释度阴性血清；f=最佳稀释度阳性血清1 纯化抗原用包被液稀释至已确定的最佳工作浓度2.以100ul/孔量加入酶标板孔中，置4C过夜或37C吸附2小时。3弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干4每孔加200ul封闭液4C过夜或37C封闭2小时5洗涤液洗3次；此时包被板可-20C或4C保存备用6每孔加100ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照邙日性、阴性对照血清为已确定的最佳
11、稀释度）和空白对照；37C孵育1-2小时；洗涤，拍干7加酶标第二抗体，每孔100ul,稀释度为已确定的最佳稀释度，37C孵育1-2小时，洗涤，拍干8加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液100ul，37C30分钟9 以 2mol/L H2SO4 终止反应10.在酶联免疫阅读仪上读取 OD 值。结果判定：待检孔的OD值/阴性孔的OD值三2.1即可判为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对 照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。筛选出的阳性克隆株以有限稀释法进行培养，待杂交瘤细胞生长至培养孔1/10或者培养上清变黄时,吸取 待检孔上清 100uL 加入检测板孔中，再次进行抗体检测，重复四次左右，直
12、至所有孔的阳性率达到 100%。四间接elisa检测杂交瘤细胞阳性株培养液上清，腹水抗体效价 筛选出的阳性克隆株培养上清，吸取 100ul 按 1:1,1:2,1:4,1:8,1:16，1:32,1:64,1:128 两倍倍 比稀释。腹水先做1:100稀释，再做 1:1,1:2,1:4,1:8,1:16，1:32,1:64,1:128两倍倍比稀释。 需要的试剂与器材： 纯化的病毒液 0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液，PH=9.6 0.5% BSA 封闭液 PBST（PH=7.4,0.01mol/LPBS， 0.05%Tween-20） 洗液 HRP 标记的羊抗鼠 IgG（HRP-IgG） l
13、2mol/LH2SO4终止液 底物显色液邻苯二胺（OPD、稀释液为柠檬酸缓冲液） 96 孔 酶 联 板，酶标仪1 纯化抗原用包被液稀释至已确定的最佳工作浓度2.以100ul/孔量加入酶标板孔中，置4C过夜或37C吸附2小时。 3弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干4每孔加200ul封闭液4C过夜或37C封闭2小时5洗涤液洗3次；此时包被板可-20C或4C保存备用6每孔加100ul杂交瘤细胞阳性株培养上清（或腹水），37C孵育1-2小时；洗涤，拍干7加酶标第二抗体，每孔100ul，稀释度为已确定的最佳稀释度，37C孵育1-2小时，洗涤，拍干8加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液100ul，37C30分钟9 以 2mol/L H2SO4 终止反应10在酶联免疫阅读仪上读取OD值。结果判定：读取OD值，待检孔的OD值/阴性孔的0D值三2.1即可判为阳性。若阴性对照孔无色或接近无 色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。采用间接 ELISA 的方法确定阳性反应的最高稀释倍数即为其效价间接 ELISA 测定杂交瘤细胞分泌抗体稳定性；测定单抗反应性方法与四类似。间接 ELISA 鉴定单抗特异性添加其他病毒抗原对比反应。
