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1、ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号RB中华人民共和国认证认可行业标准RB/T XXXXXXXX植物检疫分子水平标准物质研制规范The specification for preparation of molecular reference materials for plant quarantine（征求意见稿）（本稿完成日期2015年9月）XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施中 华 人 民 共 和 国国家质量监督检验检疫总局 发 布RB/T XXXXXXXXX目 录前言I引言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 组织要求25
2、植物检疫分子水平标准物质侯选物26 植物检疫分子水平标准物质的制备37 均匀性检验88 稳定性检验109 定值1110 质量检验1111 标准物质的保存1212 标准物质的管理1213 包装、贮存与运输12前言本标准是根据GB/T1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写中的要求进行编写的。本标准是在参考GB/T 15000.7-2012标准样品工作导则(7)标准样品生产者能力的通用要求的基础上具体和细化了植物检疫领域分子水平标准物质的技术要求。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局
3、本标准主要起草人：边勇、赵晓丽、高文娜、汪万春、王有福、刘来福、刘艳华、李岩、梁新苗、郑春生、骆卫峰、邓丛良。本标准系首次发布的认证认可行业标准。引言标准物质作为开展测量仪器校准、测量方法评价确认、测量过程质量控制等方面的重要工具，随着全世界对检测结果可靠性和可比性的不断追求，正得到越来越广泛的应用。巨大的需求推动了标准物质领域的快速发展，无论品种还是应用领域都不断得到扩展。标准物质正由钢铁、地质、环境等传统领域不断向生物、临床、新材料等领域拓展，近年来用于法医鉴定、医学诊断、基因测试、微生物检测等领域的定性分析用标准物质以及大量应用于实验室内部质量控制的的标准物质发展迅速。在理化等领域，标准
4、物质的生产体系及要求已相对规范，然而在植物检疫领域核酸、质粒等标准物质的研发尚处于起步阶段，在植物检疫领域分子水平标准物质的分类具有其自身特点。核酸的计量以含量、序列为主；蛋白质计量主要包括含量、酶活、免疫、结构等；微生物计量则刚刚开始，以鉴定和定量研究为主。由这些分类可以看出其不同于理化类标准物质的独特要求，使得其生产研制规范成为一种需求。本标准以此为目的，结合ISO/REMCO标准物质国际导则、CNAS-CL04：2010标准物质及标准样品生产者能力认可准则、CNAS-RL07:2014标准物质_标准样品生产者认可规则以及检验检疫行业标准SN/T 3461-2012植物病原菌标准样品制备要
5、求等一系列文件的具体要求为参考，以规范植物检疫领域分子水平标准物质生产的技术流程，明确制备要求和评价原则。内容涉及原料来源及真实性确认、病原扩繁规范及标准化条件、生物安全性、均匀性、稳定性、样品赋值及协作标定的技术规范；确定对以上技术规范评定的原则和一般流程、认可重点。最终指导相关生产者建立符合要求的植物检疫领域分子水平标准物质的生产体系。II植物检疫分子水平标准物质研制规范1 范围本标准规定了制备植物检疫分子水平标准物质的操作流程和技术要求。本标准适用于植物检疫分子水平标准物质的制备。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡
6、是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 15000.4 标准样品工作导则(4)标准样品证书和标签内容GB/T 15000.7 标准样品工作导则(7)标准样品生产者能力的通用要求CNAS-CL04 标准物质/标准品生产者能力认可准则JJF 1005 标准物质常用术语和定义JJF 1006 一级标准物质技术规范JJF 1186 标准物质认定证书、标签编写规则JJF 1218 标准物质研制报告编写规则JJF 1135 化学分析测量不确定度评价3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 植物检疫 plant quarantine旨在防止危险性有害生物传入和（
7、或）扩散或确保其官方防治的一切活动。3.2 原始样品 primary sample 用于制备标准物质的有害生物样品。3.3 长期稳定性 long-term stability在规定贮存条件下标准物质特性的稳定性。3.4 短期稳定性 short-term stability在运输条件下标准物质在运输过程中的稳定性。4 组织要求4.1 标准物质制备单位应具有明确的法律地位，应按GB/T 15000.7-2001中4.1规定建立质量管理体系，并获得基于GB/T 15000.7要求的标准物质生产者资质认可。4.2 标准物质制备单位应达到CNAS-CL04规定的生产者能力的通用要求，具备标准物质制备所必
8、需的工作场所、仪器设备、专业人员及管理等条件。4.3 从事植物检疫分子水平标准物质研制的场所，还应具备防范生物安全风险的条件和措施。4.4 标准物质的评审，应按照JJF1006、JJF1186、JJF1218进行文件编写。5 植物检疫分子水平标准物质侯选物5.1 侯选物的选择5.1.1 侯选物的选择应根据其预期用途确定。5.1.2 侯选物的选择应满足适用性、代表性和容易复制的原则。5.1.3 侯选物应具有足够的用量，以满足批量生产的需求。5.1.4 侯选物的纯度能够满足预期用途。5.1.5 侯选物自身应满足均匀性和稳定性的要求。5.2 侯选物的来源和真实性验证5.2.1侯选物应由标准物质制备单
9、位提供，应具有相对稳定的获得途径；5.2.2侯选物应具有可追溯的、详实的来源信息记录；5.2.3侯选物的真实性应进行验证，并确保采取的真实性验证方法有效。5.2.4侯选物真实性检验的过程应予以记录，并保存所有相关记录，必要时可由多家权威实验室进行联合验证。5.2.5通过扩繁或继代培养的侯选物，其扩繁或继代培养的流程应予以固定，并确保其目标特性量的稳定遗传。5.3 侯选物特性量的筛选5.3.1 侯选物的特性量应具有实际用途和应用价值。5.3.2 侯选物的特性量应相对稳定，其量值在可测量范围内。5.3.3 侯选物的特性量应进行适合性测试，如代表性、检测灵敏度、特异性等。5.3.4 侯选物的特性量及
10、其用途应经过专家确认，并保存相关记录。6 植物检疫分子水平标准物质的制备6.1 制备原则6.1.1 应根据标准物质的预期用途，选择合理的制备程序、工艺。6.1.2 对目标特性量不易均匀的侯选物，在制备过程中应采取必要的均匀措施，并进行均匀性检验。6.1.3对目标特性量存在不稳定因素的侯选物，在制备过程中应采取必要的稳定性措施，并进行稳定性检验。6.1.4 生产和存储分子水平标准物质的器具应确保不存在影响特性量值的因子，如吸附性、渗透性、水溶性等。6.1.5 分子水平标准物质的分装，应在特定条件下进行，避免生物、化学和物理方面的污染，同一批次所有分装单元应在同一时间完成。6.2 植物检疫性有害生
11、物基因组DNA标准物质制备6.2.1 工艺流程侯选物的选择基因组DNA的提取和纯化均匀性、稳定性检验定值测量初步定值及分装保存基因组DNA质量、含量测定标准值确定、不确定度评定6.2.2 植物有害生物的选择根据5.1，5.2，5.3规定的原则，用相应的方法对收集的有害生物进行扩繁培养、生化鉴定和特异性基因片段的PCR扩增实验，结果符合的则用相应的标准方法进行分离、纯化、培养。6.2.3 基因组DNA提取植物检疫性有害生物基因组DNA提取可以用商业化的核酸提取试剂盒，DNA提取物溶解在pH 8.0的TE缓冲液中，并在-20下保存备用。用于制备基因组DNA标准物质的DNA相对分子质量应尽可能大，因
12、此核酸提取过程中操作尽可能温和，提取过程尽量在低温下进行。另外，制备的基因组DNA必须是高纯度的，没有蛋白质和RNA污染，各种离子浓度也应符合要求，提取过程中使用的玻璃器皿、试剂、离心管等一次性用品都应经过严格灭菌消毒。6.2.4 核酸纯度和浓度测定使用紫外分光光度计分别测定230 nm、260 nm和280 nm处的紫外吸收值，计算A260/A280和A260/A230值，来判断提取的基因组DNA纯度。如果A260/A280在1.8-2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A260/A230值大于2时，说明核酸纯度较高。制备DNA标准曲线，采用PicoGr
13、een DNA分子荧光定量方法测定提取的基因组DNA浓度。6.2.5 核酸质量检查 取10 L核酸提取物进行电泳检测，0.8%琼脂糖凝胶电泳，在电压80V-100 V条件下电泳30 min，电泳条带如果清晰明亮、条带单一、无杂带和RNA，则说明提取的DNA质量很好，核酸具有完整性，可以用于核酸标准物质研制。6.2.6 核酸的分装和冷冻干燥将上述基因组DNA分装于内置微量管的样品套管中，每管DNA含量为50 L，置于冻干机中冷冻干燥。冻干后的样品在无菌条件下密封并加贴唯一性标识，放置于-80贮存。6.3 植物检疫性有害生物质粒DNA标准物质制备6.3.1 工艺流程侯选物的选择克隆基因DNA片段选
14、择设计特异性引物并进行片段扩增质粒标准物质的构建阳性克隆的筛选质粒标准物质的大量提取和纯化质量、含量初步测定均匀性、稳定性检测定值测量初步定值、分装保存标准值确定、不确定度评定基因组DNA的提取和纯化6.3.2 侯选物的选择同6.2.26.3.3 核酸提取 同6.2.36.3.4 目的基因的扩增从NCBI核酸数据库中下载目的基因全序列，通过分子生物学软件比对这些序列并进行引物设计。以提取的基因组DNA为模板，使用设计好的引物进行PCR扩增。6.3.5 质粒DNA的构建将纯化后的PCR产物连接到载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞。PCR验证挑选阳性克隆，并送测序。6.3.6 含质粒DNA的菌种的保存将测序正确的阳性克隆转化感受态细胞，以相应的抗生素抗性作为筛选标记，菌种保藏于-80冰箱。6.3.7 核酸纯度和浓度测定 同6.2.46.3.8 核酸质量检查 同6.2.56.3.9 质粒DNA的分装和冷冻干燥将经过质量评估及浓度测定的质粒DNA换算成拷贝数，并稀释到约107 copies/L，混匀后分装于内置微量管的样品套管中，每管DNA含量为50 L，置于冻干机中冷冻干燥。冻干后的样品
