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1、组织匀浆制作步骤及RNA提取1、取组织块（0.2g1g）最少可到25mg,在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5或10ml的小烧杯内2、用移液管量取预冷的匀浆介质（ph7.4,0.01mol/LTris-HCL,0.0001M0L/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖0.8%的氯化钠溶液）或者用0.86%冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍，用移液管或移液器取总量的2/3的匀浆介质或生理盐水于烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天然时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的小烧杯放入冰水中）。3、匀浆的方式有多种：手工匀浆、机器匀浆、超声匀浆、反复冻融
2、。手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（68分钟），充分研碎，使组织匀浆化。机器匀浆：用组织捣碎机1000015000r/min上下研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续35次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40
3、安培，5秒/次，间隙10秒反复35次。反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。取少量组织匀浆做涂片（直接涂片、染色均可），显微镜下观察细胞是否磨破，若没有破则可以延长匀浆时间或增加冻融次数。4、将制备好的10%匀浆用普通离心机或低温低速离心机3000r/min左右离心1015分钟，若检测ATP酶，则只需要1000转/分，离心5分钟，将离心好的匀浆留下上清弃下面沉淀。根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种测定TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离
4、RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNADNA蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。TRIzol试剂可用于小量样品（50100mg组织、5X10细胞）也适用于大量样品（1g组织、1067细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小
5、时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于NorthernBlot，dotblot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseI处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于WesternBlotting。规格：100ml黄色透明液体储存条件：28C避光保存12个月注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。预防RNase污染注意事项：1经常更
6、换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。2使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。3. RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150C烘烤4小时，塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。4. 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01%v/v,放置过夜，高压灭菌注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。RNA的提取1. 匀浆处理：a. 组织将组织在液氮中磨碎，每50lOOmg组织加入
7、lmlTRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。b. 单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可2能导致提取的RNA有DNA污染。c. 细胞悬液离心收集细胞，每510X10动物、植物、酵母细胞或1X10细菌细胞加入1mlTRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。672. 将匀浆样品在室温（1530C）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3.
8、 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于28C10000Xg离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。4. 每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。5. 2-8C10000Xg离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。6. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀
9、水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。7. 28C10000Xg离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。8. 用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1mlTRIzol至少加1ml75%乙醇。8C不超过7500Xg离心5分钟，弃上清。9. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾510分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25200口l无RNase的水或0.5%SDS,用枪头吸打几次，5560C放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子
10、甲酰胺溶解，-70C保存。Y*、八，I/r-.r*注意事项：1. 从少量样品（110mg组织或1010细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加510口gRNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70C保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75%酒精中28C星期以上或-5至-20C年以上。3分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600Xg离心3060分钟。24预期产量：1mg组织或1X10细胞提取RNA分别为：肝
11、和脾610口g，肾34口g，骨骼肌和脑组织11.5口g，胎盘14口g,上皮细胞815口g，成纤维细胞57口g。6常见问题分析：得率低：A. 样品裂解或匀浆处理不彻底。B. RNA沉淀未完全溶解。A260/A2801.65：A. 检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高。B. 样品匀浆时加的试剂量太少。C. 匀浆样品时未在室温放置5分钟。D. 吸取水相时混入了有机相。E. RNA沉淀未完全溶解。RNA降解：A. 组织取出后没有马上处理或冷冻。B. 待提取RNA的样品没有保存于-60至-70C，而保存在了-5至-20C。C. 细胞在用胰酶处理时过
12、度。D. 溶液或离心管未经RNase去除处理。E. 电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5。DNA污染:A. 样品匀浆时加的试剂量太少。B. 样品中含有有机溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。蛋白聚糖和多糖污染:沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1mlTRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl）混合离心，按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。DNA的分离准备试剂：乙醇0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）75%乙醇8mMNaOH操作步骤:1. 样品加氯仿分层后，移去上层水相，用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，28C不超过2000Xg离心5分钟。2. 移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，28C2000Xg离心5分钟，弃上清
