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1、激光扫描共聚焦显微镜技术Laser Scanning Con focal Microscope基础篇李治国细胞的内在生活显微镜的发展史没有显微镜就不可能有细胞学诞生。1590年，荷兰眼镜制造商J和乙Janssen父子制作了第一台复式显微镜。1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓，命名为cella。1680年，荷兰人 A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原 生动物。Made by A.van Leeuwe nhoek (1632-1723.Magn ificati
2、 on ran ges at 50-275x.显微镜的最重要参数分辨力显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力(resoluti on) 有关。分辨率是指区分开两个质点间的最小距离各种显微镜的分辨能力光学显微镜(light microscopy) 0.2 m电子显微镜 （Electro microscopy 0.2nm扫描遂道显微镜（seanning tunneling microscope 0.2nm以下1932年，德国人 M.Knoil和E.A.F.Ruska发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为 0.2nm的商品 电镜。1981年，瑞士人 G.Binnig和H.Roh
3、erl在IBM苏黎世实验中心（Zurich Research Center发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。常用的光学显微镜（light microscopy普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜偏光显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜激光共焦扫描显微镜普通光学显微镜原理普通光学显微镜原理图1. 构成： 照明系统 光学放大系统 机械装置2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。暗视野显微镜根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜观察到明场看不到的极其微小的物体最高分辨率可达0.004微米1原理丁达尔现象：在日常生活中，室内飞扬
4、的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的 房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这就是微粒的散射光。暗视野显微镜就是利用微粒的散射光原理设计的。2结构特点使用中央遮光板或暗视野聚光器（常用的是抛物面聚光器），使光源的中央光 束被阻挡。不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射 在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视 野是黑暗的。暗场显微镜原理3成像特点在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像，并非物体本身，所以只能看 到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于 1/2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，
5、在某种程度上可观察物体的构造。一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜（最大的分辨力为0.2um所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动 等。4应用：微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。5暗场显微镜的要求要求载玻片和盖玻片必须无疵痕和灰尘物镜前透镜必须清洁无尘载玻片和盖玻片厚度必须绝对符合要求6暗场观察方式调节（1换上暗场聚光镜（干燥系或油浸系）并在聚光镜透镜上表面滴上镜头油。 向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片底面相接触后。（2将视场光阑适当缩小，用10X物镜找到被检物体，同时在视场中看到视场 光圈的轮
6、廓象。上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈像清晰可见。（3视场光圈如不在视野中央，可利用聚光镜外侧两个调节螺丝进行调整，再 将其开大到相应位置。人的眼睛能够识别明与暗之差（光的强度）和颜色不同（光的波长不同），但 难以识别差别小的无色的透明物体。光对无色透明物体（相位物体）并不引起明、暗和颜色的变化，而只产生所谓 的相位差。可是这种相位差不能用肉眼识别，也就看不见这种相位物体了。相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提 高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射， 偏离了原来的光路，同时被延迟了 1/4 （波长），如果再增加或减少1/4入则光
7、程差变为1/2入两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象, 把相位差变成振幅差（明暗差，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反 差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物 镜相匹配的。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑。用于观察组织培养中活细胞形态结构。活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨 细胞轮廓及其结构，组织培养研究常用的是倒置相差显微镜。偏光显微镜依据波动光学原理观察和精密测定标本细节，或透明物体改变光束的物理参数 以此判别物
8、质结构的一种显微镜分辨率可达0.04微米将普通光改变为偏振光进行镜检，以鉴别某一物质具有单折射性（各向同性 或双折射性（各向异性偏振光与自然 光1. 横波的偏振性光矢量的振动方向总与光的传播方向垂直，在垂直于光传播方向的平面内，可有不同的振动方向。2. 线偏振光-光矢量只在某一固定的方向上振动。二、起偏和检偏起偏：使自然光（或非线偏振光）变成线偏振光的过程。检偏：检查入射光的偏振性的过程。双折射现象：一束光射入各向异性晶体后有两束折射光的现象。尼科耳棱镜。在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各向异性，淀粉粒、染色体和纺 锤体等具有双折射性，因此被用于组织细胞的化学研究。寻常光线（0光:遵守
9、折射定律。对于晶体一切方向都具有相同的折射率，且在入射面内传播。非常光线（e光:不遵守折射定律。它的折射率随方向而变化，并且不一定在入 射面内传播。o光和e光都是线偏振光，且振动方向相互垂直二向色性：某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）对光振动有强烈的选择 性吸收能力，这种性质称为二向色性。如电气石晶体对自然光的某一振动方向上的 光振动几乎完全吸收，而垂直于该方向的光振动只稍微减弱后通过。旋光现象：线偏振光通过某些透明介质后，它的光振动方向将绕着光的传播方 向旋转某一角度的现象，称为旋光现象。这种介质称为旋光物质。如石英、糖、 酒石酸钾钠等。微分干涉显微镜无色透明活体标本的细微结构图象呈浮雕
10、状的立体感观察效果更加逼真1原理通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，光束载极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略 有差别，使图象呈现出立体三维感觉。2特点可以使被检物体产生三维立体感觉观察效果更直观无须特殊物镜，与荧光观察配合更好可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。荧光显微镜 Fluoresce nee microscope特点：光源为短波光，信噪比高荧光显微镜一、原理荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光 （如紫外光3650入或紫蓝光4200入作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各 种不同颜色的荧光后，再通过物
11、镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景 下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分 等的研究。荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光 源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等的基础上组成的。荧光显微镜Fluoresce nee microscope特点：光源为短波光，信噪比高荧光光源一般采用超高压汞灯（50一 200W，它可发出各种波长的光，但每种 荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫 外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而 将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极
12、短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。 荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤 眼睛。二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选 择配合使用。荧光显微镜用途1观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构2标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织 内的分布。组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色 荧光，肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素 A呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内 的
13、单胺类物质（儿茶酚胺、5-羟色胺、组胺等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧 光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。3细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与 DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。4荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素 标记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合， 以检测该抗原的存在与分布。用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 缺点分辨力不高激光共焦扫描显微镜（Laser Scanning Con focal Microscope LSCM ）LSCM的基本结
14、构、工作原理荧光探针的选择原则LSCM在生物医学领域中的应用激光共聚焦扫描显微镜简介80年代研发的新型显微镜以荧光显微镜成象原理为基础采用激光扫描装置，利用计算机生成图象得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，在亚细胞水平上观察细胞，还能显 示诸如Ca 2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。发展史1、20世纪50年代中期提出。Marvi n Min sky在哈佛大学博士后工作期间，提出了共聚焦显微镜的基本概 念，并于1957年申请了技术专利。Min sky的发明并没有马上引起人们的注意，主 要原因是没有足够强度的光源，并且当时计算机的能力还不足以处理大量的数据。2、90年代发展成熟。随
15、着光学和电子技术的发展产生了更稳定和更强的激光、更高效的扫描镜片 组、高效能的光纤、更精细的镀膜技术和更低噪音的检测器。更多适合激光激发的 荧光染料不断被合成。相应的计算机处理器速度快速发展，图像显示技术增强和大 容量的存储设备的产生，推动了激光扫描共聚焦显微镜迅速普及。2006年购入OLYMPUSFV1000，耗资18.7万美元。激光扫描共聚焦显微镜结构和工作原理目标要求1. 掌握激光扫描共聚焦显微镜技术的工作原理。2. 熟悉激光扫描共聚焦显微镜的结构。3. 了解激光产生的原理4. 了解激光扫描共聚焦显微镜的功能。一、基本组成（一）激光器：多线氩离子（458 nm, 488 nm, 514 nm、氦氖绿（543nm、氦氖红 （633 nm（二）扫描器（内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单色器及检测器、荧光显微镜（装有微量步进马达 系统，实现点光源在样品上逐点逐层扫描成像（三）光学装置：根据样品中荧光信号的强弱、大小及分布，调节激光能量、 检测孔光栏、光电倍增管（PMT ）的检测范围、物镜和电子放大倍数（zoom）， 以利于采集各种荧光信号。（四）计算机图像存储与处理及控制系
