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1、实验三 培养基的制备、灭菌一、实验目的和要求1. 学习培养基的配制方法。2.掌握高压蒸汽灭菌的原理和方法。二、培养基的配制 培养基是人工配制的适合于微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。其中含有碳 源，氮源，无机盐，生长因子和水等。并且要根据微生物的需求调节其酸碱度及培养基的状 态。所以学习培养基的配制是很重要的环节。其主要步骤是：玻璃仪器的清洗及干燥f制做棉塞一配制液体培养基（加凝固剂配制 成固态培养基）f调节酸碱度f过滤、灌装及包扎f灭菌f检验。下面介绍重要的几步操作。1.制做棉塞：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起过滤作用，避免空气中的 微生物进入容器内。所用的棉花应是透气性很好
2、的新鲜衣棉。制做棉塞时，要求棉花紧贴玻 璃壁，没有邹纹和缝隙，松紧适宜。过紧易挤破管口和不易塞入，过松易掉落和污染。棉塞 的长度约为管口直径的23倍，棉塞应有2/3塞进管内（见下图）。）IE确（卜（巧不#礎棉塞制作过程2.配制液体培养基：培养基应先配制成液态的。按配方准确称出各种原料，用总量的 1/21/3的水将原料溶解，难溶的可稍加热溶解。3配制固态培养基：按配方称好凝固剂，用少量水调成糊状，待液态培养基煮沸后，离 开电炉将糊状的凝固剂倒入内混匀，并且补足配方所需的水，再加热煮沸。4. 调节酸碱度：培养基的酸碱度可用精密试纸或酸度计来测量。调节时可用 10氢 氧化钠或 10盐酸进行调节酸碱度
3、，调节时要特别注意避免过头再回调，因为这样容易影 响培养基的体积和渗透压。最后检查总体积是否足量，少了补充水份，多了稍加热蒸发水份。5. 过滤分裝：若有杂质或固形物，用两层纱布趁热过滤（气温低要保温过滤）。分裝时加入试管的量为试管长度的1/51/4.锥形瓶约为容积的1/31/2。分裝时不得使培养基沾污瓶口及试管口，以免浸湿棉塞，造成污染。（见下图）分装培养基摆斜囲6. 加棉塞：培养基分装后，将做好的棉塞塞好，再包上一层防潮纸，用绵绳系好。在 防潮纸上标明培养基的名称、制备组和姓名、日期等。准备灭菌。7灭菌：灭菌是指杀死一定环境中的所有微生物。高压蒸汽灭菌是湿热灭菌的一种。 其原理是通过加热使微
4、生物体内的蛋白质凝固变性，达到杀菌的目的。蒸汽灭菌的优点是蒸 汽穿透力强，使蛋白质易于凝固变性，另外灭菌过程中产生的蒸汽凝固在物体的表面，同时 放出大量的潜热，这种潜热能迅速提高灭菌物体的温度，缩短灭菌的全过程。是灭菌效果最 好的一种方法。其操作过程如下：1）在灭菌锅内加适量的水，再把用灭菌的物品放入锅内，盖上锅盖，对称地拧紧螺栓， 以防漏气。2）灭菌锅开始加热，同时打开排气阀，待将锅内冷空气完全排净后排气阀内有热气排出35分钟后将排气阀关闭。至压力表升至压力为0.01MPa或温度为121C时开始计时。 通过调节电源或调节排气阀维持一定的压力（温度）。达到灭菌时间后（20分钟）停止加热。 （在
5、灭菌过程中应保持恒温恒压）3）待压力表降至 0 位后，再打开排气阀，打开锅取出灭菌物品。试管要制成斜面时， 待试管温度降到50C60C时再摆成斜面，过早会产生较多的冷凝水。4）最后将锅内的水倒出，以防生锈。8.检验：检验的目的是检查配制的培养基灭菌是否彻底。将灭菌后的培养基置于37C恒温 箱中保养2448小时，若无菌生长，证明灭菌彻底，可保存备用。三、实验材料和器材1、培养基及试剂：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、琼脂粉、苯酚、氢氧 化钠、盐酸等2、器材及耗材：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、恒温干燥箱、电炉、电子天平、 250mL、 100mL烧杯、试管、250mL三角瓶、漏斗、棉花
6、、量筒、玻棒、10mL移液管、粗棉线、园塑 料篓，产气管等四、实验操作步骤具体配法：每2人称取x克营养琼脂（每2人配100mLx克见试剂瓶上所标的），于100mL 的烧杯中，然后用100mL的量筒量取100mL蒸馏水，用少量的蒸馏水倒入烧杯中将称好的营 养琼脂脂搅拌成稀糊状，然后转入锥形瓶（注意不要把培养基沾到瓶口上，以免沾污棉塞而 引起污染），在将剩余的蒸馏水分数次将烧杯中的剩余的营养琼脂转入锥形瓶，最后加足 100mL 蒸馏水，塞好棉塞后，再在棉塞外包一层牛皮纸，然后用棉线将牛皮纸扎好，于 121C 20分钟高压蒸汽灭菌。冷却后取2 3瓶置于37C恒温培养12天，经检验确定无菌后方 可使用。五、实验结果记录将灭菌结束后冷却的培养基置于37C恒温箱中保养2448小时，是否有杂菌生长，证 明灭菌是否彻底，是否可保存备用。六、实验结果分析及问题讨论
