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1、重组锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFN)技术与转录激活因子样效应 蛋白核酸酶 (transcription activator-like effector nucleases, TALEN) 技术 是可以对基因组进行定点修饰的基因编辑技术，可精确地定位到基因组的某 一 位点上并剪断靶标 DA 片段从而插入新的基因片段，从而对原基因组进行“编 辑”。ZFN技术依赖于特异性识别并结合DNA的锌指蛋白和FokI核酸内切酶可剪 切结构域组成的融合蛋白，可切割特异DNA序列并引起DNA双链断裂(double- strand breaks, DSB), DSB激活细胞的DNA
2、修复机制,从而定点修饰 基因组。 TALEN是山转录激活因子样效应物(TALE)代替ZF与FokI核酸内切割 域组成的基 因编辑工具。一、 结构与原理ZFN技术中，锌指结构域通常III 3-6Cys=-His=型锌指单元审联而成，他们借 助一个Zf形成0 0 a构象，其中a螺旋中的-1, +3, +6位的三个氨基酸直接与 靶DNA的三联碱基相互作用。这三个残基中的任一残基的改变都会影响ZF对目 标碱基的识别。根据U的基因设计8-10个锌指结构域并与FokI结合可构成靶向 特定位点的ZFNs,在FokI切割域的二聚化作用下完成对口的基因的编辑。TALE蛋口包括三部分：端序列 C端序列、由高度保守
3、的重复单元组成的 中心重复区。每个重复单元中除12、13位氨基酸可变外其余儿乎相同，12、13位 的两个氨基酸被称为重复可变的双氨基酸残基 (repeat varible di-residues, RVDs)。RVD与A T C、G之间有着严格的对应关系，即NI-A： NG-T； HD-C； NN-Go构建TALE时，根据靶DNA序列变换RVDs并串联重复单元并与FokI切割结 构域结合，TALE与靶位点结合，二聚化的FokI对其进行切割，完成基因编辑操 作。二 ZFN TALEN异同点比较与ZFN相比，TALEN的优势是十分明显的。第一，TALEY简化了 ZFN复杂的 筛选过程，在简单的分子
4、克隆条件下就可构建出高效的TALEN；第二，TALEY结合 DNA序列更为严格，打靶效率高于ZFN：第三，TALEN降低了脱靶的可能性，从而 降低了对受体细胞的毒性。详细比较如下：2.1 共同点1. 二者均为人工改造的核酸内切酶，山特异性识别靶DNA的识别域和 非特异性剪切dsDNA的切割域，他们配合着行使功能，缺一不可。2. ZFN. TALEY 中的 FokI 是源于黃单胞杆菌的一种限制性核酸内切酶， 它只有形成二聚体时才对dsDNA具有剪切活性。3. FokI切割DNA后的修复机制相同：在两个靶位点之间剪切DNA,在 DSB处诱发DNA的同源重组修复机制和非同源末端连接修复机制，从而达到
5、 定点修饰。2. 2 不同点1. 开发时间：最早的ZFN出现在18年前，而TALEN技术才于2007年 问世。2. 靶DNA序列的识别：ZF结构域识别的是三联碱基，而TALEN结构域 识别的是某特定的核昔酸。例如：某蛋口包括两个锌指结构域，可识别六个 碱基；而当它包括两个TALEN结构域时即两个RVD,仅能识别两个碱基。此 夕卜，TALEN的RVD与碱基之间的对应关系与物种、细胞、DNA序列无关，并 且设计简单，成本低，与 ZFN 相比活性更高。3. 上下文依赖效应：ZFN在识别DNA序列时，重复氨基酸之间会产生相 互作用，也就是上下文依赖效应，从而使得识别的特异性发生了改变，影响 基因修饰效
6、率。还未见 TALEN 上下文依赖效应的相关报道。4. 对细胞的毒性效应：锌指酶切割DNA时易产生脱靶现象，对细胞产 生了毒副作用。 TALEY 脱靶情况较少，毒性小。例如：通过点对点地比较二 者对人细胞内源基因CCR5的删除效果，发现在效率大体相同的情况下，U 前实验数据显示TALE所产生的细胞毒性比ZFN小得多。5. 靶向基因序列长度：与ZFN相比,TALEN可以识别更长的靶基因 序列。三、存在的问题与展望口前，ZFN技术还存在以下困惑：锌指蛋口结构域与DNA结合的特异性、亲 和性有待提高；如何让解决ZFN的高效导入、可调控切、瞬时表达问题；ZFN对 细胞的潜在综合作用需进行综合评价，并对
7、引起的潜在免疫反应，尤其是针对于 源于细菌的 FokI 结构域的客观评价。同样地，TALEN技术还存在以下问题：设计识别20个碱基含有1000多个氨 基酸的TALEN蛋白，会引起机体的免疫应答，降低了其在细胞中的打靶效率； TALEN同样会产生脱靶的现象，可能由于细胞中染色体的状态引起，如TALEN技 术对于异染色质化的基因无效；TALEN技术的应用主要集中在基因敲除方面， 但是否适合大片段基因的插入尚不明确。ZFN、TALEN技术为人们定向改造基因提供了基础，但相关应用还处于初级 阶段，但他们在转基因动植物的研究方面尤其是TALEN技术在基因治疗上仍 然 显示出了巨大的应用价值。2012年 Science 在评述中把TALEN称为基因组的 “巡航导弹”，还大胆预测TALEN技术将成为所有分子生物学实验室都要掌握 的基本 实验技能。
