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1、一、PC12细胞的折光性本来就比较好，刚传代以及新分裂的细胞都是亮的，至于你说的贴 壁的细胞，不知道是否是圆的，在牛血清的刺激下，特别是国产的，会使pc12细胞发生定 向的分化，长突起，贴壁就比较牢。PC12分为未分化的和分化的前者是球状，成团生长;后者形成很多丝状体;而丁香园里有 人说楼主的这种细胞严格来讲已经不能算是PC12 了.前几天为自己养的 PC12 是未分化还是分化型困扰，查了一些资料，现发上来希望能给有 同样问题的战友有一点帮助!培养条件:PC12细胞培养于铺有鼠尾胶原的玻璃培养瓶中，置于C02培养箱（37C,95%空 气5%C02），培养基选用DMEM（pH,高糖），加入10%
2、灭活小牛血清及5%灭活马血清。 分化前:PC 12细胞在培养基中多呈圆形，直径1520 um,也有椭圆或多角形的，扁平的细胞 少见，倾向于聚集成小团簇状（A图）。分化后:加入NGF后的24 h内细胞停止分裂，长出似交感神经元样的突起;第414 d ,细胞 体积增大，突起增多并增长，形成网络，数周后，突起可长达5001000 u m（B 图）。NGF可促进PC12细胞向类似交感神经元样的形态分化，最终导致PC12细胞在生理、生化方 面都具有神经元样的功能12。分化后的PC12细胞对ACh的敏感性增大57倍 有的战友提到分化的PC12药敏性更好是不是因为分化后的PC12细胞对ACh的敏感性增 大
3、57 倍二、我养这个细胞一年多了，有点经验和大家交流一下。1. 我用的是15的马血清和%的胎牛，胎牛要用进口的，国产的容易分化。2. 关于表面处理的问题，值得注意的是胶原和多聚赖氨酸使细胞贴壁的原理不太一样。多聚 就是纯粹的物理黏附作用，而胶原则是刺激的细胞，使细胞的表达一些能有助于贴壁的蛋白， 这种刺激作用还涉及到 MAPK 途径，所以如果做细胞信号转导的战友要注意到这点。相关 的文献可以自己到 pubmed 上查找。3. 完全分化的细胞不能传代，因为贴壁已经很牢固，强迫其脱离可能造成，尤其是细胞的突 起断裂，细胞存活率很低。4. 用 NGF 刺激的 2448h 后，细胞可以消化下来传代或者
4、冻存，用于继续培养。一般这种 细胞叫做NGF activated cells。用于检测待测物的NGF样活性，指标是细胞突起的程度。5楼上有照片贴出来细胞呈现梭形，严格讲这种细胞已经不能叫做PC12 了。严肃的话最好 放弃。6该细胞容易聚集生长，传代种到新瓶子之前最好充分吹打，把细胞弄匀，否则传的细胞也 呈现聚集的团，很难看。我的经验是消化液用 EDTA 加比较稀的胰酶，这样消化的细胞比 较容易成单细胞悬液。三、我目前已经养PC12 一个多月了，经验谈不上很多，不过失败的教训倒是不少，可以拿 出来和大家分享一下1细胞的培养基，我开始用10%FBS国产四季清的，DMEM,没加马血清和多聚赖氨酸什
5、么的，因为条件关系，结果细胞贴壁性很好，生长速度还可以，3天1：2传代，在传到第5 代时候，观察细胞状态下降，正常对照组也开始出现调亡，后查文献发现血清用多了，分析 其内含有大量刺激生长物质，导致细胞出现分化，状态不稳定，目前改用 5FBS， DMEM， 细胞生长速度明显放慢，现5天1： 2传代，这和ATCC上PC12的倍增时间92小时比较接 近。2传代时候的细胞密度，有人说传代时候细胞过密，可能导致细胞分化，但是我在细胞仅50 60传代，细胞死亡率很高，因此目前改用80传代，还算稳定，确实有分化的迹象，如， 细胞出现多角形等，但属轻度，和楼主说的差不多，可能和我用国内血清有关。3胰酶对PC1
6、2无效。我个人提出胰酶消化PC12是个错误观点，其一针对悬浮PC12，胰酶 消化的效果不好证实，其二，我养的PC12，性质贴壁，用100%胰酶消化1小时，愣是没 动静，细胞甚至不变圆。最后用力拍打才可以，但代价是细胞损伤非常大，不好恢复。其三， ATCC上明确建议用细胞刮勺刮取PC12，目前我改用刮勺，细胞传代后状态要比用胰酶消 化的好很多。4再者关于1640和DMEM的问题，我个人观点，二者的主要区别在于DMEM含糖量高， 神经细胞都喜欢这，另外1640含一些离子，是防止培养的细胞贴壁。 1640一开始主要应用 于单克隆抗体的制备，其后因其比较适合国内特点，比如价廉物美啊，所以目前在很多细胞
7、 上都有应用，ATCC上建议用1640，更多的原因是防止贴壁，诱导分化。不过，2种培养基 我都试过，好像在国产 5%血清的条件下， 1640 培养基不能改变 PC12 性状。所以我采用 DMEM，能量高啊。5.因此我个人认为，5%的FBS，DMEM，足够PC12生长需要，4天左右1： 2传代，可以 不用贴壁处理（国产血清诱导轻度分化），如要求严格未分化，请参照ATCC推荐。四、ATCC上明确说PC12倍增时间为48小时。低分化:PC 12细胞在培养基中多呈圆形,，也有椭圆或少量多角形的，扁平的细胞少见,倾向于 聚集成小团簇状；高分化:细胞长出似神经元样的突起,培养一定时间后,细胞体积增大,突起
8、增多并增长,可形成 网络。细胞发生的分化的原因无非就是自发和诱发的，你这种情况诱发的可能性较大，我觉的是不 是你的血清用的不当比如浓度偏高，再核对一下血清浓度，或者细胞接种密度太高、太低。 由于血清中的各种生长因子和以及细胞代谢的自由基是最常见诱发细胞分化的因素。张均田主编的神经药理学研究技术与方法中提到:在培养液中加入NGF (50ng/ml),可促 使PC12细胞分化正像上面的朋友们说的在培养液中加入NGF(50ng/ml)会使pc12分化而具有神经细胞的形态 特征但要分化 48 小时以上才能看出来，表现为细胞体增大，有突触外伸。但需要注意的是 分化后的细胞贴壁能力下降，因此在更换培养液时
9、要小心，最好事先把培养皿用5ug/ml的 poly-L-lysin处理一下，这样即使分化后也不易剥离了。还有就是NGF对玻璃的粘着性很强， 在使用和保存时一定要用塑料容器。pc12在未分化时贴壁生长，但最好用5%HS,5%FBS/DMEM培养液，据说PC12在完全没有 HS的培养液中贴壁不好。我用的是CORNING的培养皿，PC12贴壁很好。已经经过胶原 蛋白处理的，因此贴壁很好。2. 为何要自己处理成分化型的呢，上海脑所就有分化型的细胞株买。3. 分化型的不用PLL处理的，但你如果不放心，可以用ml的PLL处理过夜就可以了。其 实如果经费不足的话，国产的1%明胶同样处理过夜就可以了。PLL和
10、明胶都用灭菌的去离 子水配。分化的PC12细胞不用胰酶消化，未分化的才需要消化，就用的胰酶消化就可， 消化时在显微镜下观察突起变短，胞体变圆时就直接用培养基终止消化。五、PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，具神经内分泌细胞的一般特征，因其 具可传代特点，广泛应用于神经生理和神经药理学研究。关于这株细胞，血清的使用比例大家是怎么配的？看文献在马血清和胎牛血清的使用上很不 同。大部分文献是10%马血清，5%胎牛。而ATCC更是15%马+%胎牛1640和DMEM到底有多大区别？绝大部分人都用1640,也有小部分用DMEM,而 ATCC是说 用 F12。我用的是 1640。10%马血清，5%
11、胎牛血清和双抗。pcl2细胞分为分化的和没有分化的，只有分化了的PC12才具神经内分泌细胞的一般特征， 广泛应用于神经生理和神经药理学研究。在一次性塑料培养皿上包被collagen或PLL都可以使分布均匀，贴壁良好，用我们公司的高结 合力培养器皿和包被collagen相当或贴得更牢一些其他实验我很少做，也就不清楚了.可以看看1976年Greene LA关于PC12细胞建系的文章，PUBMED上有全文：我养的是高分化的pc12细胞，培养基用高糖DMEM+10%HS+5%FBS+双抗，消化用胰酶 + %EDTA,挺好养的还在养细胞吗？事隔三年了。呵呵高分化了你当时也加了马血清吗？是的，还是要用 1
12、0的马血分化的:10%马血清+5%胎牛血清+1640（DMEM长的稍快）不分化的:1015胎牛血清+1640（DMEM长的稍快）挺好养的，不能长得太满 70%汇合就该传代了第二篇1用NGF处理后，PC12细胞就会发生分化，所谓分化就是其长出突触，变成一种完全类似 交感神经元的一种细胞模型。因为成为了神经元的细胞模型，所以这种发生分化的细胞是不 具有增殖能力的。2但是传说中的高分化的PC12的好像是一种细胞株，它类似于处在未分化PC12细胞跟NGF 处理后发生分化的PC12之间的状态。它仍具有分离增殖的能力，性状长期保存。还是一种 肿瘤细胞株。但是它在培养过程中贴壁生长，多边形而非圆形；未分化的
13、PC12与之不同表 现为悬浮生长，圆形。但是我到ATCC查了一下只有PC12的介绍，它所描述的PC12就是 未分化的PC12, ATCC中并无高分化的PC12。而我周围同学包括园子里很多帖子讲到作试 验所用的高分化的PC12细胞株是在上海典型培养物保藏中心买到的。我就不知道这个高分化的PC12是不是国内一种细胞株呢？我看的很多外文文献要么是用未分化的PC12，要么使用NGF诱导分化的PC12，但是从来 没有见到过高分化的PC12细胞株。我不知道这个细胞株是不是国际公认的。细胞英文名称PC-12 PC12细胞中文名大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞形态特性多角形 生长特性 疏松贴壁，有多细胞聚集体特征特性
14、该细胞系来自可移植的雄性 大鼠的肾上腺嗜铬细胞瘤；表达神经生长因子(NGF)受体，NGF可诱导该细胞产生可逆性的 神经表型。该细胞可产生儿茶酚胺、多巴胺和去甲肾上腺素，但不合成肾上腺素。培养基 RPMI 1640 (w/o Hepes)血清5%FBS+10%HS其它因子无传代方法 1:3传代； 34天 1 次。传代情况 C5冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性二、关于PC12的一点看法众所周知,PC12是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系，属神经嵴源性,具有神经细胞特性.由于具有分化型和未分化型两种形式,因此很多朋友包括我本人在内都困惑过做实验时应该 选择哪种类型?根据最近查到
15、的资料发现,无论分化型还是未分化型,都可以作为神经细胞来使用,分化型的 PC12 可以看待为成熟的神经元,因为无论形态还是生化特征都与神经细胞类似.而未分化型 PC12可以看待为未成熟的神经元.值得注意的一个问题是，关于PC12培养液的使用，无论是DMEM还是1640，如果希望保持细 胞的未分化状态,一定要添加马血清,用以封闭牛血清中可能促进其分化的某种成分 ,否则细 胞就会渐渐分化这种分化是一种不完全的分化，其形态并非像加入NGF之后那样完全分化.有人说这样的细胞不能用于实验，但是通过国内外很多文献发现，许多实验研究都是用没有添 加马血清的 PC12 做的，因此个人观点也认为这样的细胞是可以
16、用于实验的，可以看作是未成 熟的神经元向成熟的神经元分化过程中的过度状态.总体来说,PC12的资料很多很多，是国际上公认的神经细胞模型我本人做的是神经细胞毒性 实验，因此选择未分化型细胞即可满足需要.当然也可以选择分化型，没什么不妥.注意PH值，微酸则代谢较慢，不能换液太勤。应该注意以下几点：细胞复苏一定要过关，培养液可以用1020%的1640,但是最好用collegan或PLL报被板 子；而没有必要用文献中的10H5F培养液！ pc12细胞应该是很好养的，我养PC12从来没 用PLL或collagen包被。你的问题应该主要是冻存的细胞有问题。三、关于细胞冻存问题还真不少。一年前我老板从美国带了五个不同的细胞株回来，其中有 的公认很难伺候，但是本人硬是一次
