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1、中国药科大学生 物 工 程 文 献 综 述综述题目CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗的研究进展和展望英文题目Current situation and development trend of CAR- T cell for tumor immunotheraphy专 业 生物制药（卓越工程师）院 部 生命科学与技术学院 学 号 14404806 姓 名 龙益如 CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗的研究进展和展望14404806 龙益如摘要：嵌合抗原受体修饰的细胞（CAR-T）治疗是一种新型的肿瘤免疫治疗方法。在多种血液肿瘤的临床试验中，CAR-T细胞疗法取得重大突破，在实体瘤的临床试验中也初见成效。但在
2、获得显著疗效的同时, CAR-T也存在持久性、归巢、脱靶效应、神经毒性、细胞因子风暴、插入突变、对实体肿瘤疗效有限等问题。现就CAR-T技术的最新进展与该领域有待解决的问题进行综述，以期初步了解该技术的发展前景与问题分析。关键词：嵌合抗原受体修饰的T细胞；肿瘤；免疫治疗 Current situation and development trend of CAR-T cell for tumor immunotheraphyAbstract：A lot of remarkable results suggested that the modification of T-cells with C
3、ARs could be a powerful approach for developing safe and effective cancer therapeutics .A novel breakthrough has been made in CAR-T treatment of hematologic tumors and therapeutic potential in clinical studies of solid tumors has been achieved , although there are still many problem for CAR-T on the
4、 clinical application such as off-target effect, cytokine storm ,insertion mutagenesis, limited effects for solid tumors. Here, we reviewed the recent advances of CAR-T and problems that need to be solved in this flied. Keyword: Chimeric antigen receptor T cells ; Tumor ;Immunotheraphy前言现当代社会，癌症是世界四
5、大致死率最高的非传染性疾病（心血管疾病、癌症、糖尿病和慢性肺疾病）之一。据世界卫生组织统计，每年约880万人死于癌症。人类抗肿瘤历史已经100多年，取得了显著的成就，然而离攻克肿瘤难题仍然任重道远。免疫学研究的蓬勃发展为肿瘤诊疗策略的革新带来了许多振奋人心的突破。免疫疗法成为国际公认的继外科手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗模式，被成功用于多种肿瘤的治疗。自1985年来，美国国立卫生研究院（National Institutes of Heath,NIH）就把肿瘤的生物治疗列为肿瘤综合治疗第四大方式。2000年举行的国际肿瘤生物基因治疗年会也指出：“ 生物治疗是目前知道的唯一有望完全消灭癌细
6、胞的治疗手段，21世纪是肿瘤生物治疗的世纪”。2011年国际权威杂志自然与临床肿瘤学分别发表题为“ 肿瘤免疫治疗的时代已经来临”的评论文章，指出未来免疫细胞治疗可能在肿瘤综合治疗中占据非常重要的位置。美国科学杂志更是将肿瘤免疫治疗列在2013年度突破性研究进展第一位，认为其是肿瘤治疗的重大转折点。2015年美国临床肿瘤学会年会发布的ASCO年度报告：2015临床肿瘤学进展中，将嵌合抗原受体基因修饰T细胞治疗技术作为实现复发性白血病治疗突破的前兆。近期，麻省理工科技评论公布了“2016年十大突破技术”，这些技术代表了当前世界科技的发展前沿和未来发展方向，反映了近年来世界科技发展的新特点和新趋势；
7、而“ 免疫工程-杀伤性T细胞”位居榜首。本文将以介绍CAR-T细胞疗法的发展现状为基础，并分析CAR-T细胞疗法所存在的问题、可能的解决方法与机遇展望。1 CAR-T细胞的概念和发展历程1.1 CAR-T细胞的概念嵌合抗原受体修饰的T细胞（Chimeric antigen receptor for T cells , CAR-T）疗法是将抗体对抗原的高度特异性和T细胞对靶细胞的细胞毒活性相结合的一种方法：通过基因重组获得表达嵌合抗原受体的T细胞，经过纯化、体外扩增和活化，输注回患者体行使杀灭肿瘤细胞的功能。CAR-T细胞通过其表达的CAR能特异性地识别并杀伤肿瘤细胞，属于精准肿瘤免疫细胞治疗。
8、目前已有大量研究针对不同肿瘤靶点设计出相应的CAR-T，在临床研究中验证其可行性，取得了显著疗效。CAR的基础设计中包括一个胞外的肿瘤相关抗原（Tumor-associated antigen , TAA）结合区，通常来源于多克隆抗体抗原结合区域的scFv（Single-chain variable fragment），一个穿膜区和一个胞信号区，将其有序地结合在一起，并组装在T细胞上。当CAR受到特异性抗原识别后可为T细胞提供活化信号并通过胞结构域转导该信号，引起T细胞的活化，从而发挥T细胞杀伤作用，并释放大量细胞因子对肿瘤细胞进行攻击。1.2 CAR-T细胞治疗的抗肿瘤机制和发展历程1.2.
9、1 CAR-T细胞治疗技术的发展历程目前针对T细胞的肿瘤免疫治疗主要包括免疫检查点抑制剂疗法和T细胞过继疗法两大类，CAR-T细胞疗法属于后者。传统的过继免疫治疗主要采用肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes ,TIL）。这种免疫治疗策略有一定的疗效，但是获得新鲜的肿瘤组织并分离和扩增TIL具有难度，回输的TIL细胞功能受损，在体往往不能有效识别肿瘤细胞；同时，肿瘤中强大的免疫抑制微环境降低回输细胞的杀伤能力，这些问题限制了TIL疗法的广泛应用，仅对黑色素瘤等少数肿瘤有一定疗效，对大多数肿瘤疗效欠佳。随着T细胞过继疗法的发展，具有高效特异性、杀伤活性和持
10、久性的CAR-T细胞疗法应运而生，成为肿瘤免疫治疗的新星.目前，CAR-T细胞治疗技术可分为四代，主要是依据其胞信号结构域的差异来划分，我们将在下文中提与。1.2.2 CAR-T细胞治疗的抗肿瘤机制理解CAR-T的抗肿瘤机制，首先需了解T细胞是如何活化并杀伤肿瘤细胞的。T细胞的活化需要双信号途径。第一信号为细胞表面受体（T cell receptor , TCRs）与抗原递呈细胞上的主要组织相容性复合物（MHC）结合，第二信号为抗原递呈细胞上的共刺激分子B7家族分子与T细胞上的配体CD28分子结合，产生协同刺激信号。在双信号共同刺激下，T细胞活化增殖为细胞毒细（cytotoxic T cell
11、，CTL）。当CTL再次遇到携带相同抗原肽复合体的肿瘤细胞时，就会与之结合，并分泌穿孔素、颗粒酶，直接介导肿瘤细胞溶解，也可诱导巨噬细胞分泌促炎因子IL-12等，间接影响肿瘤细胞的生长。CAR-T细胞免疫治疗是利用基因工程的方法，将识别目标抗原的单链抗体与间隔区、跨膜基序和T细胞活化基序等结合为一体，利用融合基因修饰的T细胞特异性杀伤肿瘤细胞。1.2.3 CAR-T的结构CARs是靶向目标表面分子的重组受体，其结构主要包括胞外抗原结合域、跨膜区和胞信号区三部分,如以下图所示：胞外抗原结合域为单克隆抗体的单链可变区，负责识别抗原。不同于生理性的TCR，重组CARs与抗原的结合不需要依赖于MHC的
12、递呈，有效避免了肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制；同时，CARs不仅能够与蛋白质结合，还能识别糖类、神经节苷脂、蛋白多糖、高度糖基化的蛋白，更加广谱地杀伤肿瘤细胞。跨膜区连接胞外抗原结合域和胞信号域，一般由二聚体膜蛋白组成，主要包括CD3、CD4、CD8、CD28等，能将CARs结构锚定于T细胞膜上。跨膜区不同的设计能影响导入的CAR基因的表达。有研究发现，CD28的跨膜区较CD3的跨膜区能更多地表达CAR基因。胞信号域采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM），通常是TCR/CD3FcRI，当胞外区与其识别的抗原结合时，就会向胞传导TCR样信号。根据胞信号域结构的差异，CAR可划分为四代。
13、第一代CAR结构只有一个胞信号组分（TCR/CD3链和FcRI链），能够识别靶抗原并激活细胞，无共刺激分子，不能转导增殖信号和诱导细胞因子产生，T细胞无法增殖，因而杀伤肿瘤效果甚微。第二代CAR细胞增加了一个共刺激分子，如CD28、CD27、41BB（CD137）、OX40（CD134）或者可诱导共刺激分子，即便没有外源性共刺激分子T细胞也能持续增殖并释放细胞因子。虽然二代CAR大大提高了T细胞抗肿瘤疗效，但仍未全面开启T细胞的杀伤能力，于是诞生了包含两个共刺激分子（CD28、41BB和CD3）的第三代CAR。小鼠实验说明三代CAR能够增强细胞因子的分泌、抑制肿瘤生长。最近出现的第四代CAR又
14、称TRUCKs，结构与前三代不同，引入促炎症细胞因子（目前主要是IL-12）和共刺激配体（41BBL和CD40L），可以在具有免疫抑制性的肿瘤微环境过释放促炎性因子，招募并活化更多的免疫细胞而引起更为广泛的抗肿瘤免疫效应。并且，第四代CAR的出现可使患者免受回输前预处理治疗（全身照射或大剂量化疗）的不良反应，减少回输细胞总量，拓宽了CAR-T细胞的临床应用围。2 CAR-T的基因转导稳定转染是效应细胞稳定表达CAR的前提。目前用于CAR-T的基因转导载体主要有逆转录病毒和慢病毒。如需获得短暂存在的CAR-T细胞，则用mRNA转染。不同于病毒载体长久地插入基因组，RNA转染是一种快速高效的转染方
15、式。但由于细胞不能稳定持久存在，往往需要输注大量的T细胞以保证疗效。此类mRNA转染的CAR-T目前还处于早期临床试验中。3 CAR-T的生产培养患者或捐赠者的外周血是细胞的主要来源。一般而言，T细胞是在CD3和CD28的刺激下，或与外周血单个核细胞共培养，经过10d至3周的体外培养获得。IL-2是体外扩增中最常用的细胞因子。有研究显示，IL-7联合IL-15能扩增出干细胞样的记忆性T细胞，能在体更好存活，具有更强的抗肿瘤效应。临床治疗过程中回输的CAR-T细胞数量目前尚无定论，有研究认为回输的T细胞数目越多疗效越好，也有研究认为回输CAR-T需要严格控制细胞数量，应从低剂量开始，降低严重不良反应发生的可能性。4 CAR-T的抗肿瘤效应和与临床转化4.1 抗血液肿瘤效果CAR技术在血液系统恶性肿瘤治疗中取得了令人瞩目的成绩。靶CD19的CAR-T细胞在临床上研究最多，在CAR-T靶点开发领域具有里程碑式的意义。2010年，美国国家癌症研究所的研究说明，CD19特异性的CAR-T用于治疗晚期淋巴瘤疗效明显。随后，
