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1、RNA 原位杂交中的探针（一）探针的种类RNA 探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链 cDNA 或 cRNA分子。根据在RNA杂交中所使用的探针依其来源可分为三种：即特异性cDNA、cRNA 探针和人工合成寡核苷酸探针。1. 单链cDNA探针：由于cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列,又克服了双链cDNA 探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链 cDNA探针的制备比较困难，在RNA原位杂交中已很少见有应用。2. cRNA探针：是以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针，因此 也 避免了应用双链cDNA探针
2、做杂交反应时存在的两条之间的复性问题ocRNA与RNA之 间形成的杂交体要比cDNA-RNA杂交体稳定。cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA 酶的影响。因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。由于cRNA探针具有 以上这些优点，cRNA探针的杂交饱和水平又比双链DNA探针高出8倍，因此在原位杂交 中应用广泛。cRNA探针的缺点是：探针的制备过程比较复杂，需要较好的分子生物学实验 设备，它对RNA酶敏感，易受破坏，操作中要谨防RNA酶污染。3. 寡核苷酸探针：人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成，避免 了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。由于大多
3、数寡核苷酸序列较短，不需 要纯化，组织穿透性极好。根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。合成的 寡核苷 酸探针的缺点是：探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太 短可形成非特异性结合。它与mRNA形成的杂交体不如cRNA-RNA杂交体稳定，再则 探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。依标记物不同，探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。前者主要包括 3H、35C、32P和125I等，不同的同位素探针其穿透力，定位和半衰期各不相同，无一种 同位素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。由于半衰斯短，性能不稳定，污染 环境和危害健康等原因，在RNA原位杂
4、交中应用同位素标记探针已日趋减少，而非同位素 标记探针在近年来得到迅速发展，其标记物主要有生物素、地高辛、酶和荧光标记等。其中 地高辛标记的 cDNA、 RNA 和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了 生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点，其应用越来越广泛。（二）探针的标记在RNA原位杂交中，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。探针标记 法有酶反应法和化学反应法。1. 酶反应法：用于RNA探针的酶反应法主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将 标 记物导入线型DNA或RNA的5端或3端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核苷酸 探针的标
5、记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。2. 体外转录法：体外转录法是一种制备与克隆片段序列相同的单链RNA探针的方法。进行 体外转录时，先将靶核苷酸序列克隆到含噬菌体转录启动子的载体中，然后在RNA聚合 酶的作 用下，以 DNA 为模板，以含有标记的三磷酸苷为原料，对启动子下游的序列进行 转录，而启动子本身并不被转录。体外转录常用噬菌体转录启动子，如沙门氏菌噬菌体和 大肠杆菌噬菌体T3、T7o当两个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多克隆位点的两侧， 用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将质粒线性化。SP6噬菌体的RNA聚合酶对SP6 启动子序列具有高度的亲和性，从而启动下游的转录，在
6、4种三磷酸核糖核苷和相应的噬菌 体RNA聚合酶存在的条件下，即转录成RNAo如反应物中含有标记的三磷酸核糖核苷，所 有的RNA就被标记。依标记物为同位素和非同位素，近年来非同位素标记探针已有了极大的近步。常用非同位素 标记技术有生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素。非同位素标记法又可分 为直接标记法和间接标记法。直接标记法是将标记物直接结合到探针上，当探针与组织内相 应靶核苷酸结合后，即可显色观察。这类标记探针必须符合标记物在杂交过程中不丢失，又 不影响杂交反应为条件。大量已发表的文献表明，由于检出杂交信号受到多种因素制抑，只 能限于靶RNA丰富的细胞或组织中，RNA杂交对低拷贝的
7、基因检测不理想。近年来间接标 记法得到较快发展，先将标记物结合在探针上，通过特异性抗体识别，由特异性抗体结合多 种酶，对检测的杂交信号作有放大，这一类标记法已展示极好的发展前景。(三) 探针的纯化 某些标记探针必须经纯化后方可使用。这是因为在探针标记过程中，反应液中仍存在一些未 被结合到探针中去的剩余dNTP等小分子。为将掺入并结合到cDNA、cRNA和标记寡核苷 酸与游离的标记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化。乙醇沉淀法 的原理是：DNA可被乙醇沉淀，而未掺入DNA的dNTP则保留在上清液中，由此反复乙 醇沉淀能将两者分开。核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的原理是：
8、交替使用酚、氯 仿这两种不同的 蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质杂质的效果。因为酚虽能有效地变性蛋 白质，但它不能完全抑制RNA酶的活性，而且酚能溶解10-15%的水，从而溶解一部分 ploy(A)RNA。为克服这两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于RNA提取，显得更加重要， 氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。(五)杂交前探针的选择1. RNA探针:RNA探针的长度以50-150碱基为佳，探针易进入细胞，杂交率高，杂交时间 短。长500个碱基的探针杂交时间约需20个小时左右，如超过500个碱基的RNA探针则 在杂交前用有限碱基水解法控制其长度。孵育时间t = Lf- Lo / K
9、 X Lo XLf (Lo =核酸探针原长度(kb), Lf=核酸探针水解 后 所需长度(kb)，K是常数率=0.11kb/min)。(2) 在室温中加入下列试剂终止水解：3mol/L醋酸钠，6.6卩1(终浓度0.1mol/L)，醋酸1.3卩1(终 浓度为 0.5%)。(3) 加入下列试剂沉淀探针：7mol/L醋酸铵100 ul，100%乙醇750 ul，RNA (10mg /ml) 2卩 l，置-20C 2小时后恢复到室温，在1400rpm离心30min。(4) 小心将乙醇倒出，待试管内干燥后再用无菌ddH2O稀释到10ng/ u l浓度。(5) 最终探针长度可于10%聚丙稀酰胺凝胶在60C
10、的尿素中电泳检测。2. 探针的长度 原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度，探针浓度必须给予该实验最大信噪比，因为 背景着色度高低与探针浓度有关。最佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸的最大饱和结合 度为目的。探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记cRNA探针的浓度为0.5ng/ul，而 非 放射性标记cRNA探针的浓度1.0ng/ul。杂交液的量要适当，每张切片以30-50 u l为 宜。保持杂交液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必须彻底，应用杂交罩等也很必要。3. 杂交的温度和时间设置和调整杂交温度是RNA原位杂交的重要环节。杂交温度应低于解链或融解温度(melting temperature Tm)20-30C。多数RNA原位杂交Tm为95C，由于这一温度对保存组织形态完 整和组织切片的粘附将产生不利影响，为此在杂交液中常以增加甲酰胺浓度来降低Tm值， 因为每增加1%甲酰胺浓度可降低0.72C。另外杂交体中GC的百分比，杂交体长度以及 杂交液中Na+的浓度也与Tm呈正相关。杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过 长会增加非特异性着色。一般RNA原位杂交采用杂交孵育过夜，在黑暗环境下进行，可以 避 免光线对甲酰胺的电离作用。
