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1、微生物染色液配制及染色法2.1 美蓝染色法 2.1.1 吕氏碱性美蓝染色液美蓝 0.3g95% 乙醇 30mL0.01% 氢氧化钾溶液 100mL 将美蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。 2.1.2 染色法将涂片在火焰上固定，待冷。滴加染液， 染13min，水洗，待干，镜检。2.1.3结果菌体呈蓝色。2.2革兰氏染色法2.2.1结晶紫染色液结晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸铵水溶液 80mL将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。2.2.2革兰氏碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL 。 2.2.3
2、 沙黄复染液 沙黄0.25g95% 乙醇 10mL 蒸馏水 90mL 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 2.2.4 染色法 2.2.4.1 将涂 片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。2.2.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。2.2.4.3滴加95%乙醇脱色，约30s ；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。224.4 水洗，滴加复染液，复染 1min 。水洗，待干，镜检。 2.2.5 结果革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红 色。注：亦可用 1 ：10 稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需 10s 。2.3 耐酸性染色法 （萎倪二
3、氏法 ）2.3.1 石炭酸品红染色液碱性品红 0.3g95% 乙醇 10mL5% 酚水溶液 90mL 将品红溶解于乙醇中 ，然后与酚溶液混合 。 2.3.2 3% 盐酸乙醇浓盐酸 3mL95% 乙醇 97mL2.3.3 复染液吕氏碱性美蓝染色液。 2.3.4 染色法 2.3.4.1 将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸品红染色液，徐 徐加热至有蒸气出现，但切 不可使沸腾。染液如因蒸发减少时，应随时添加。染 5min ，倾去染液，水洗。 2.3.4.2滴加盐酸乙醇脱色，直至无红色脱落为止（所需时间视涂片厚薄而定，一般为 13min），水洗。2.3.4.3滴加吕氏碱性美蓝染色液，复染30s1min，
4、水洗，待干，镜检。2.3.5结果：耐酸性细菌呈红色，其他细菌、细胞等物质呈蓝色。2.4 柯氏染色法 2.4.1 染色液 2.4.1.1 0.5% 沙黄液。 2.4.1.2 0.5% 孔雀绿液。 2.4.2 染色法 2.4.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加 0.5%沙黄液，并加热至出现气泡，约23min，水洗。2.4.2.2滴加0.5%孔雀绿液，复染4050s。水洗，待干，镜检。2.4.3结果布氏杆菌呈红色，其他细菌及细胞呈绿色。2.5 奥尔特氏荚膜染色法 2.5.1 染色液沙黄 3g 蒸馏水 100mL 用乳钵研磨溶解。 2.5.2 染色法将涂片在火焰上固定，滴加染色液，并加热至产生蒸气后，继
5、续染3min。水洗，待干，镜检。2.5.3结果炭疽芽胞杆菌菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。2.6 瑞氏染色法 2.6.1 染色液瑞氏色素 0.1g 甲醇 60mL 用乳钵研磨溶解。 2.6.2 染色法 2.6.2.1 涂片待自然干燥后，滴加染色液，固定1min。2.6.2.2加入等量蒸馏水（pH6.5），染色35min。2.6.2.3用蒸馏水冲洗，待干，镜检。2.7鞭毛染色法2.7.1染色液的配制2.7.1.1甲液：称丹宁酸5g、氯化高铁（FeCI3）1.5g，溶于100mL 蒸馏水中，待溶解后加入 1%的氢氧化钠溶液 1mL 和 15%的甲醛溶液 2mL。 2.7.1.2 乙液：称 2g 硝酸银
6、溶于 100mL 蒸馏水中。在 90mL 乙液中滴加浓氢氧化铵溶液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后 用其余 10mL 乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止（此为关键性操作，应特别小心 ）。滴加氢氧化铵和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用，23d基本无效。2.7.2染色法在风干的载玻片上滴加甲液，46min后，用蒸馏水轻轻冲净。再加乙液，缓缓加热至冒汽，维持约半分钟（加 热时注意勿使出现干燥面 ）。在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，干后镜检，菌体及 鞭毛为深褐色到黑色。 2.8 碱性复红染色法将 0.5g 碱性复红染料溶解于 20mL95%
7、乙醇中，然后用蒸馏水 稀释至 100mL 。如有不溶物时，可用滤纸过滤，或静置后取上清液备用。注：本染色液系用于苏云金芽胞 内蛋白质毒素结晶的染色，藉以与蜡样芽胞杆菌相区别实验用染色液及试剂的配制1黑色素液 水溶性黑素 10g ，蒸馏水 100mL, 甲醛（福尔马林） 0.5mL 。可用作荚膜的背景染色。2墨汁染色液 国产绘图墨汁 40mL ，甘油 2mL ，液体石炭酸 2mL 。先将墨汁用多层纱布过滤，加 甘油混匀后，水浴加热，再加石炭酸搅匀，冷却后备用。用作荚膜的背景染色。3 吕氏 (Loeffier) 美蓝染色液A 液：美蓝 (methylene blue, 又名甲烯蓝 )0.3g, 9
8、5% 乙醇 30mL;B 液： 0.0l% KOH l00mL 。混合 A 液和 B 液即成，用于细菌单染色，可长期保存。根据需要可配制成稀释美蓝液，按1：10 或1 ： 100 稀释均可。4革兰氏染色液(1) 结晶紫 (crystal violet) 液：结晶紫乙醇饱和液 (结晶紫 2g 溶于 20mL95% 乙醇中 )20mL ，1% 草酸铵 水溶液 80mL 将两液混匀置 24h 后过滤即成。此液不易保存，如有沉淀出现，需重新配制。(2) 卢戈(Lugol)氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加 入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至 300mL 即成。
9、配成后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色即不能使用。(3) 95% 乙醇：用于脱色，脱色后可选用以下 (4)或(5)的其中一项复染即可。稀释石炭酸复红溶液：碱性复红乙醇饱和液(碱性复红1g, 95%乙醇l0mL, 5%石炭酸90mL混合溶解即成碱性复红乙醇饱和液 )，取石炭酸复红饱和液 l0mL 加蒸馏水 90mL 即成。(5)番红溶液：番红 O(safranine ，又称沙黄 O)2.5g, 95% 乙醇 100mL ，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶 中，用时取 20mL 与 80mL 蒸馏水混匀即可。以上染液配合使用，可区分出革兰氏染色阳性(G+)或阴性(G-)细菌，G-被染成蓝紫色，G+被染成淡
10、红色5. 鞭毛染色液A 液：丹宁酸 5.0g, FeCl3 1.5g ， 15% 甲醛(福尔马林 )2.0mL ， l%NaOH 1.0mL ，蒸馏水 l00mL;B 液： AgNO3 2.0g, 蒸馏水 100mL 。待 AgNO3 溶解后，取出 l0mL 备用，向其余的 90mLAgNO3 中滴加 NH4OH ，即可形成很厚的沉 淀，继续滴加 NH4OH 至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止，再将备用的 AgNO3 慢慢滴入，则溶液出现薄 雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，继续滴入 AgNO3 ，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀 为止，如雾重，说明银盐沉淀出，不宜再用。通常在配制当天便
11、用，次日效果欠佳，第3 天则不能使用。6. 0.5%沙黄(Safranine)液：2.5%沙黄乙醇液20mL，蒸馏水80mL。将2.5%沙黄乙醇液作为母液保 存于不透气的棕色瓶中，使用时再稀释。7. 5%孔雀绿水溶液：孔雀绿 5.0g，蒸馏水100mL。8. 0.05% 碱性复红：碱性复红 0.05g ， 95%乙醇 100mL 。9. 齐氏(Ziehl)石炭酸复红液：碱性复红0.3g溶于95%乙醇l0mL中为A 液: 0.01%K0H溶液l00mL为B液。混合A、B液即成。10 姬姆萨 (Giemsa) 染液（1）贮存液：称取姬姆萨粉 0.5g ，甘油 33mL ，甲醇 33mL 。先将姬姆
12、萨粉研细，再逐滴加入甘油，继续研磨，最后加入甲醇，在56 C放置1 24h后即可使用。（2）应用液 （临用时配制 ）：取 1mL 贮存液加 19mL pH7.4 磷酸缓冲液即成。亦可取贮存液：甲醇=1：4 的比例配制成染色液。11 乳酸石炭酸棉蓝染色液（用于真菌固定和染色）石炭酸（结晶酚）20g，乳酸20mL，甘油40mL , 棉蓝 0.05g ，蒸馏水 20mL 。将棉蓝溶于蒸馏水中，再加入其他成分，微加热使其溶解，冷却后用。滴少量 染液于真菌涂片上，加上盖玻片即可观察。霉菌菌丝和孢子均可染成蓝色。染色后的标本可用树脂封固，能长期保存。12. 1%瑞氏（Wright 染色液：称取瑞氏染色粉 6g，放研钵内磨细，不断滴加甲醇 （共600mL）并继续研磨使溶解。经过滤后染液须贮存一年以上才可使用，保存时间愈入，则染色色泽愈佳。13 阿氏 （Albert） 异染粒染色液：A液：甲苯胺蓝（toluidine blue）0.15g ，孔雀绿0.2g，冰醋酸lmL， 95%乙醇2mL，蒸馏水100mL;B 液：碘 2g, 碘化钾 3g ，蒸馏水 300ml 。先用 A 液染色 1min ，倾去 A 液后，用 B 液冲去 A 液，并染 1min 。异染粒呈黑色，其他部分为暗绿或浅绿
