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1、The DNA damage response induces inflammation and senescence byinhibiting autophagy of GATA4DNA 损伤反应通过抑制GATA4 自噬诱导炎症和老化introduction ：细胞衰老是一个由多重应激导致基因表达变异和扩增的过程。 虽然这也是一种潜在的肿瘤抑制机制， 但衰老机制也参与了一些病理过程， 包括老化，年龄相关的疾病， 甚至与致瘤机制有关。 衰老细胞能分泌一些衰老相关分泌表型 SASP 影响自身的微环境，这些 SASP 包括前炎性细胞因子，趋化因子，生长因子和蛋白酶。 SASP 启动和维持的机制以转
2、录因子 NF-B和 C / EBPb 为特征的经典炎症调节机制。rational：P53 和 p16INK4a/ RB 是衰老过程的两个重要核心调控通道。不依赖于p53 或 p16INK4a 的另一种独立衰老调控通路能调节SASP。根据 miR-146a 的启动子片段开发了一种绿色荧光蛋白标记的衰老信号，可以检测到人类成纤维细胞衰老过程中的 miR-146a。 衰老诱导刺激物能激活SASP，包括复制疲惫， DNA损伤，致癌 RAS 激活。RESULTS:通过对 miR-146a 启动子的分析，我们定位衰老诱导活化的关键区域并确定了转录调控因子 GATA4 在衰老调控中的作用。正常情况下， GA
3、TA4 与 P62 自噬体结合发生选择性自噬而被降解。在衰老反应中， GATA4 和 P62 反应减弱可以抑制这种自噬反应。 GATA4 通过诱导能激活 NF-kB 通路的因子启动和维持 SASP，从而可以促进衰老过程，这些因子包括肿瘤坏死因子受体相关蛋白2 和 IL-1A 。GATA4 通路的活化同 p53 和 p16INK4a 通路活化机制相似，需要 DDR 激酶 ATM 和 ATR 的活化。不同的是， GATA4 通路是不同于 p53 和 p16INK4a 的另外的独立通路。 GATA4 蛋白大量存在与衰老刺激物诱导的老鼠、正常老化的老鼠及人的多个组织中，包括脑细胞，这些发现均提示GAT
4、A4 通路参与年龄相关性炎症反应的过程。CONCLUSION: 我们的结果说明 GATA4 通过 TRAF3IP2 和 IL-1A 激活的 NF- B 通路参与自噬反应、 DDR 所致的衰老及炎症过程。 GATA4 通过 DDR 调控衰老是不同于 P53 和 p16INK4a 通路的独立通路的关键。 我们认为衰老细胞量积聚的 GATA4 能通过炎症反应促进老化和疾病，而抑制GATA4 通路可能为疾病的治疗提供了一个新方向。细胞老化是应激反应的最终阶段，由P53 和 p16INK4a肿瘤抑制蛋白调控。老化的显著特征是一种与肿瘤生长和老化相关的前炎性反应，SASP。已经证实转录因子GATA4 可以
5、调控老化和SASP。正常情况下，GATA4能通过 P62 介导的选择性自噬作用降解，而衰老反应则可使GATA4 保持恒定。Text：在应激状态下，细胞老化是一种防止异常细胞进一步扩增的机制。细胞老化抑制细胞和组织的再生能力， 衰老细胞的消除有助于诱导老化模型鼠的老化相关表型的表达。 而如何接收衰老信号启动老化反应的具体调节机制并不清楚。多种衰老刺激信号能引起哺乳动物细胞进入不可逆的生长阻滞期， 这些信号包括复发扩散导致的端粒的缩短、 DNA 损伤以及活化癌基因的表达。衰老细胞除了能引起细胞生长阻滞外， 在基因表达中也有很大的作用， 包括 SASP 的表达。在生理状态下， SASP 因子可以通过
6、自分泌和旁分泌的方式加强衰老细胞的生长阻滞，老化细胞能刺激癌前细胞或癌变细胞扩增形成肿瘤。另一方面， SASP 激活免疫系统可以抑制肿瘤，而当衰老细胞在发挥作用被移除后可以促进受损组织的修复。 SASP 可以直接或间接地促进与一些年龄相关性疾病的慢性炎性因子的分泌。尽管 SASP 由很广泛的生物学活性，但是对于 SASP 产生的 NF-kB 经典途径以外的作用却是有限的，比如 CCAAT/ 增强子结合蛋白b (C/EBPb)， IL-1a 和 P38MAPK 。在老化刺激下 NF-kB 炎性反应被激活的机制亦是未知的。与老化生长停滞相比， P53 和 p16INK4a/Rb 肿瘤抑制途径有重要
7、的作用，SASP 并不依赖于 P53 和 p16INK4a/Rb 肿瘤抑制途起作用， 而是有自己独立的衰老调控通路。与急剧的正常炎性反应相比， SASP 反应很缓慢，到老化细胞生长阻滞通常需要几天的时间，这将提供一个衰老特异性的激活机制。除了转录调控外，自噬通过 target of rapamycin(TOR) autophagy spatial coupling compartment(TASCC)影响 SASP 的形成。 TASCC 通过 mTOR 与自噬溶酶体氨基酸残基结合而起到促进分泌蛋白质合成的作用。 也有研究表明抑制自噬在某些条件下能促进老化。因此，自噬和老化之间的关系暂时还不清楚
8、。GATA4, a novel senescence regulator我们分析了 microRNA 在非老化细胞和衰老人成纤维细胞的表达， 通过复制疲惫诱导老化并发现 miR-146a 在老化细胞中高度表达。 我们猜测 miR-146a 调控主要发生在转录水平的初始阶段。我们将 1.5-kb miR-146a 启动子片段融合如绿色荧光蛋白中 PmiR-146a-GFP。miR-146a 在一些老化诱导因子作用下表达增加，包括复制疲惫、电离辐射及致癌基因RAS 的表达。通过ECB 浏览器，我们发现miR-146a 有两个高度进化的保守域， ECR1 和 ECRU2。ECR2 对基因活性有重要的
9、作用，因为 ECR2 有 NF-B 结合部位，而 NF- B 能调控 miR-146a，我们从药理学和遗传学角度抑制了完全表达SASP 的衰老细胞的 NF- B 通路 。而衰老细胞中只有部分NF- B 被抑制，这个结果表明其它的转录因子也作用于激活miR-146a 关联的细胞老化。为了确定其它转录因子的活性，我们搜查了那些被预测能结合 ECR2 的转录因子。我们逐一将搜查 13 个转录因子过度表达并检测 miR-146a 的活性，只有 GATA4 符合条件。在衰老细胞中， siRNA GATA4 被耗尽。 ChIP-qPCR 显示 GATA4 表达与 miR-146a ECR2 直接连接 。G
10、ATA4 是一种锌指转录因子，在各种器官的发育中是必不可少的，包括心脏，睾丸，前肠，肝，和腹侧胰腺。为了检测GATA4 的功能，我们研究了异位表达或缺乏在人二倍体成纤维细胞老化反应中的影响。 GATA4 异位表达诱导人包皮成纤维细胞和 IMR-90 成纤维细胞的老化，通过增加 SA-b-Gal 的活性及减少 BrdU 的合成 。更重要的是，通过稳定表达 shRNA 导致 GATA4 耗尽能部分下调 IR 诱导的 SA-B-Gal 的活性和延迟复制性衰老。 这是由于 GATA4 发生 CRISPR 突变。这些数据表明 GATA4 对老化有正性调节作用 。在衰老中 GATA4 有调控作用，而在肺，
11、结肠癌，前列腺癌，卵巢癌和乳腺癌中，则保持沉默。Selective autophagy suppresses GATA4 and senescence在检测 GATA4 siRNA 的效率时，我们发现 GATA4 的量在衰老细胞中增加。事实上，丰富的 GATA4 蛋白，而不是 mRNA ，能增加 IR-和癌基因诱导的衰老和复制老化。这是由于蛋白质稳定性提高， 通过放线菌酮和全球蛋白质稳定性分析检测蛋白质的稳定性。 在真核细胞中有两个主要蛋白质降解途径： 泛素蛋白酶体和自噬溶酶体途径。 用 MG-132 抑制蛋白酶体， MG-132 是一种蛋白酶体抑制剂，对 GATA4 没有影响，而 GATA4
12、 蛋白在溶酶体抑制剂（溶酶素 A 、E64d、胃蛋白酶抑制剂）存在的细胞中稳定表达。这些发现提示自噬溶酶体途径能调控GATA4。自噬部件 ATG5 或 ATG7 同样能上调 GATA4 蛋白。自噬可以通过特异性自噬受体介导途径选择性地降低某些基物。 事实上，自噬受体 P62 的耗尽能增加 GATA4 蛋白。衰老过程中外源性表达和源性 GATA4 与 p62 相互作用减弱。因此，在正常条件下， GATA4 与 P62 发生特异性作用发生自噬，而在老化中，可能与 P62 的相互作用减弱， GATA4 变得稳定了。衰老与自噬之间的关系目前还不清楚。自噬在老化或抑制老化过程中是必不可少的 。我们结果可
13、以解释这些矛盾。选择性自噬可能会通过抑制衰老调控因子如 GATA4 来防止老化。然而，衰老诱导刺激物可以引起 GATA4 逃脱选择性自噬 。随后，非选择性自噬可能激活有助于老化。因此， GATA4 的选择性自噬可能对老化的起到负性调节作用。如果是这样，瞬时抑制自噬可引起衰老。 为了验证这一点，我们利用多西环素（阿霉素）诱导的 shRNA 耗尽 ATG5 或 ATG7 和瞬时抑制自噬，使 GATA4 增加，然后通过去除多西环素恢复自噬， 使细胞达到一个可老化的状态。 短暂抑制自噬（高浓度 GATA4，自噬 on）诱导的衰老比持续性抑制自噬（高浓度 GATA4，自噬off ）更有效，这种效果，至少
14、在一部分取决于GATA4。连续和短暂抑制自噬使获得同样的 GATA4 浓度，但连续抑制未能诱导衰老。在正常状态下， P62 缺乏比自噬调节受体 ATG7 或 ATG5 的缺乏更有效率的诱导老化。 因此，选择性自噬可以成为 GATA4 的抗衰老机制，而非选择性自噬则是促衰老机制 。GATA4 regulates the SASP为了确定 GATA4 调节老化的机制，我们探究了 GATA4 是如何影响人成纤维细胞基因表达的。 GATA4 异位表达时可以诱导老化，我们利用阿霉素诱导 GATA4 载体在 GATA4 表达之前和之后对 RNA 转录普进行测序。我们根据基因本体论系统描述了GATA4是如何
15、影响细胞进程的。基因表达GATA4的增加对一些应答是有意义的，如免疫应答、炎症反应、创伤反应，而GATA4 的表达减少则与细胞周期的生理过程有关。我们比较了GATA4 基因集和与增殖老化基因集的区别，无论基因是上调还是下调均有意义，而基因的上调更具统计学意义，说明GATA4 有转录激活因子的作用。结果说明 GATA4 可能激活一部分老化相关基因。在 GATA4 调节的老化相关基因中我们发现了很多SAPA 基因，这些基因能编码IL6, IL8, CXCL1, 粒 -巨细胞集落刺激因子(GM-CSF), 细胞外基质蛋白激酶和抑制剂。炎症应答和免疫应答中的细胞因子和趋化因子由老化细胞分泌，可以改变细胞微环境，增强老化阻滞，GATA4 通过 SASP 可能直接调节其他的老化表型，尤其是生长阻滞。 GATA4 的异位表达通过Rt-q
